Resumen de Small molecules for modulating biological targets

Laia Miret Casals

• Resum Capítol 1 Les malalties respiratòries infeccioses són malalties que afecten els conductes d¿aire, els bronquis i els pulmons. Aquestes malalties oscil¿len des d¿infeccions agudes, com per exemple la pneumònia i la bronquitis, fins a condicions cròniques com són l¿asma, la fibrosi quística i la malaltia pulmonar obstructiva crònica. Les infeccions de pulmó respiratòries són les principals causes de morbidesa i mortalitat a tot el món, amb un considerable cost humà, social i econòmic. Les malalties respiratòries infeccioses poden ser causades per un número creixent de bacteris multi resistents als antibiòtics que existeixen actualment. Els bacteris que normalment habiten en les mucositats poden créixer fora de control i colonitzar i infectar els pulmons. Les alteracions en les mucositats tendeixen a la formació de micro-ambients bacterians coneguts com a biofilms, aquests són difícils de penetrar pels antibiòtics i les cèl¿lules immunitàries. Els biofilms estan implicats en diferents infeccions patogèniques en el cos, com són les infeccions urinàries o d¿orella, o poden causar greus infeccions en malalties com la fibrosi quística, la bronquièctasi i la malaltia pulmonar obstructiva crònica. Els biofilms són els responsables del 65% de totes les infeccions bacterianes. Uns enzims indispensables pels bacteris són els enzims ribonucleòtids reductases (RNR), els quals produeixen els desoxiribonucleòtids per la síntesi d¿ADN. Aquests enzims són necessaris pel creixement i per la germinació de l¿espora del patogen. Hi ha tres classes d¿enzims RNR, la classe I, II i III. Tots tres enzims creen un radical lliure a un residu de cisteïna, que està conservat en el lloc actiu, i així, inicien la reducció dels ribonucleòtids per a la síntesi i reparació de l¿ADN. Aquestes tres classes d¿enzims es diferencien en el mecanisme per generar el radical lliure, en el cofactor que necessiten, en la regulació al¿lostèrica, en l¿estructura quaternària i finalment en la dependència d¿oxigen. Tot i aquestes diferències significatives, les tres classes d¿enzims conserven l¿estructura tridimensional del cor catalític i comparteixen mecanismes catalítics similars. La classe I depèn d¿oxigen i només funciona en condicions aeròbiques, ja que la generació del radical tirosil necessita oxigen. La classe II és funcional en condicions aeròbiques i anaeròbiques i la classe III en condicions anaeròbiques. Una molècula capaç d¿inhibir l¿enzim RNR pararia el creixement del bacteri, esdevenint una estratègia terapèutica important en el tractament de les malalties respiratòries infeccioses. Els organismes eucariòtics només codifiquen una classe de RNR, per la classe Ia. En canvi els bacteris codifiquen per més d¿una classe de RNR depenent del medi on viuen. Normalment, hi ha un RNR predominant que és el responsable del creixement bacterià, i els altres RNR presents responen a altres mecanismes de regulació diferents al de la classe dominant. L¿objectiu d¿aquest primer capítol està enfocat en trobar inhibidors específics dels enzims RNR de quatre línies cel¿lulars de bacteris diferents: Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Staphylococcus aureus http://en.wikipedia.org/wiki/Haemophilus_influenzaei Bacillus anthracis, que són els organismes més comuns causants d¿infeccions oportunistes en pacients que pateixen malalties respiratòries. P. aeruginosa és un dels pocs bacteris que codifiquen per les tres classes de RNR (Ia, II, i III). La classe Ia i II han estat detectades durant el creixement bacterià. B. cenocepacia codifica la classe RNR Ia pel creixement en condicions aeròbiques en combinació amb la classe RNR II, que és independent d¿oxigen. S. aureus depèn de la classe RNR Ib pel creixement en condicions aeròbiques i en condicions anaeròbiques la classe III és essencial. Per últim, B. anthracis codifica per la classe RNR Ib en combinació amb la classe III, que només és funcional en condicions anaeròbiques. La majoria de bacteris Grams-positius depenen de la classe RNR Ib pel creixement bacterià en condicions aeròbiques. Nosaltres estem interessats a sintetitzar hidroxilamines específiques que actuïn com a radicals capturadors del radical tirosil de la classe RNR I bacteriana sense que afectin l¿enzim RNR humà. Busquem inhibidors de la classe RNR I perquè vivim en condicions aeròbiques. El primer fàrmac antiproliferatiu utilitzat per inhibir l¿enzim RNR va ser la hidroxiurea, que actua com a radical capturador reduint el radical tirosil de l¿enzim RNR. Torrents i al. van publicar un estudi on ensenyaven que el radical tirosil de l¿enzim RNR Ib (NrdF) és una possible diana terapèutica per a fàrmacs amb activitat antibacteriana basada en radicals capturadors. La hidroxilamina i la N-metilhidroxilamina van ser identificades com a potents inhibidors pel tractament de l¿àntrax, una infecció produïda per B. anthracis. Aquestes dues molècules inhibien el creixement del patogen a diverses ordres de magnitud de concentracions més baixes que la HU. A més a més, la N-metilhidroxilamina no és tòxica pels humans8. Per tant, els derivats de la N-hidroxilamina i N-metilhidroxilamina podrien ser utilitzats com a fàrmacs amb activitat antiproliferativa per combatre les infeccions bacterianes de pulmó. El nostre grup amb col¿laboració amb el grup del Dr. Torrents, líder de les infeccions bacterianes i teràpies antimicrobianes de l¿Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC), vam enfocar la nostra recerca en desenvolupar una llibreria química basada en derivats d¿àcids hidroxàmics i N¬¬-hidroxilamines que presentessin millors activitats antibacterianes que les descrites fins al moment, bloquejant els efectes del radical tirosil en l¿enzim RNR,. L¿objectiu del projecte era trobar inhibidors específics de l¿enzim RNR (classe I) sense que afectin la classe Ia RNR d¿humà, la qual s¿expressa en cèl¿lules eucariotes. En primer lloc la síntesi dels àcids hidroxàmics es va intentar utilitzant l¿estratègia en fase sòlida amb la resina 2-CTC. Es va incorporar el residu N-Fmoc-hidroxilamina a la resina a través d¿un atac nucleòfil del grup hidroxil amb DIEA en DCM. A continuació, es va eliminar el grup Fmoc amb piperidina i DMF, i es va acoblar l¿aminoàcid protegit (Fmoc-aa-OH) utilitzant el sistema TBTU-HOAt-DIEA per formar l¿enllaç amida. Finalment, el grup Fmoc va ser eliminat i l¿amina lliure va ser acetilada utilitzant AcOH i DIPCDI en DCM. Un cop tenim l¿àcid hidroxàmic, aquest s¿escindeix de la resina amb tractament àcid utilitzant DCM-TFA 97:3 (v:v) i els protectors de la cadena lateral son eliminats amb TFA-H2O 95:5 (v:v). Després de comprovar la puresa per HPLC-PDA i HPLC-MS l¿àcid hidroxàmic és purificat per l¿HPLC semi preparatiu de fase reversa (veure l¿esquema 1). Esquema 1. Síntesi dels àcids hidroxàmics Seguint aquest esquema sintètic, es va preparar una petita llibreria de 6 compostos. Els derivats dels àcids hidroxàmics contenien diferents aminoàcids per tal d¿obtenir la mateixa estructura amb diferents cadenes laterals. Figura 1. Llibreria d¿àcids hidroxàmics sintetitzats El procés de purificació dels àcids hidroxàmics és molt costós a causa de la petita mida i de la polaritat de les molècules. A més a més, després del pas d¿acetilació s¿obtenen productes secundaris que són difícils de separar. Tots aquests problemes fan que el rendiment de la síntesi sigui molt baix i s¿obtingui molt poca quantitat del producte. Per això, aquesta estratègia va ser descartada. Tot i això, els productes dels quals es va obtenir més quantitat, Ac-Asp-NHOH i Ac-Ala-NHOH, van ser provats en B. anthracis i van donar actius. Els compostos inhibeixen el creixement del bacteri. A més a més, l¿activitat inhibidora de B. anthracis del Ac-Asp-NHOH és més bona que la N-metilhidroxilamina, utilitzada com a control positiu. El següent pas va ser la síntesi de derivats d¿hidroxilamina a partir d¿amines primàries. L¿oxidació d¿amines primàries i secundàries dóna lloc a les hidroxilamines, que continuen tenint un parell d¿electrons desaparellat i poden ser vulnerables a oxidacions. És per això, que la síntesi directa de N-alquilhidroxilamines a partir d¿amines primàries utilitzant agents oxidants és complicada, a causa dels problemes de sobreoxidació que donen lloc als compostos nitrós i nitro. Els mètodes més utilitzats per oxidar amines primàries a N-alquilhidroxilamines és utilitzant el peròxid d¿hidrogen, l¿àcid m-cloroperbenzoic (que està associat a problemes de sobreoxidació), el dimetildioxirà, l¿oxone suportada sobre gel de sílice o d¿alúmina o el peròxid de benzoïl. Aquest últim mètode necessita el tractament del producte intermediari, que és un O-acil-N-alquilhidroxilamina, amb àcid o base, per obtenir la hidroxilamina lliure. Primer de tot, vam intentar oxidar les amines primàries a N-alquilhidroxilamines utilitzant el complex de peròxid d¿hidrogen i urea i el tungstat de sodi com a catalitzador en èter. Aquest procediment va ser utilitzat per amines primàries diferents i únicament es va obtenir el producte de partida. En un cas, quan la reacció es va deixar tota la nit reaccionant, l¿amina primària s¿havia sobreoxidat donant com a producte el grup nitrós. Per tant, es va decidir utilitzar un altre procediment. A continuació, vam utilitzar l¿oxone, que està compost per 2KHSO5¿1KHSO4¿1K2SO4, com a agent oxidant. L¿oxone suportada sobre gel de sílice oxida amines primàries a hidroxilamines amb dissolvent o sense utilitzant el microones. Aquesta reacció es va portar a terme amb oxone suportada sobre gel de sílice, sense dissolvent i al microones a diferents temps. Utilitzant aquestes condicions, únicament es va obtenir el reactiu de partida. En canvi, en utilitzar oxone suportada sobre gel de sílice en benzè a reflux a 80 °C o en un sistema bifàsic (H2O/DCM) a temperatura ambient, obteníem el material de partida, mescles de productes que contenien la hidroxilamina i subproductes més oxidats (nitrós i nitro) o únicament els productes sobreoxidats. La mescla de compostos no es podia separar del compost desitjat i es va decidir provar un altre procediment. Finalment, vam decidir utilitzar el peròxid de benzoïl com a agent oxidant. Les amines primàries reaccionen amb el peròxid de benzoïl en DCM donant lloc a l¿intermedi O-acil-N-alquil hidroxilamina, que per hidròlisi en condicions àcides o bàsiques dóna lloc a la hidroxilamina desitjada. Inicialment, en portar a terme la reacció, únicament obteníem el producte secundari, que és la benzilamida. Però, en utilitzar el peròxid de benzoïl en una solució aquosa saturada de K2CO3 vam aconseguir obtenir el producte desitjat en rendiments baixos. Es van provar diferents condicions per augmentar el rendiment de la reacció, com per exemple, es va provar la base LiOH, es va augmentar i disminuir la temperatura, es van provar diferents dissolvents en condicions bàsiques o neutres, es va provar una solució tampó i es van variar els equivalents de peròxid de benzoïl. Finalment, les millor condicions van ser les següents: utilitzar la solució aquosa de K2CO3 en ACN (1:1) (v:v) a 4 °C, o utilitzar una solució tampó a pH 10.5 en DCM a 4 °C, encara que els rendiments continuaven sent baixos. Els productes secundaris obtinguts van ser incorporats a la llibreria, ja que és una pràctica habitual en la recerca de la química mèdica (veure figura 2). Un cop havíem obtingut el producte intermedi O-acil-N-alquil hidroxilamina, el següent pas era la hidròlisi en condicions àcides o bàsiques. Primer vam provar la hidròlisi en HCl en THF a 100 °C, i únicament obteníem el 4-clorobutan-1-ol, que és el producte obtingut degut a l¿addició del Cl- en el THF. Per tant, vam decidir canviar el dissolvent i utilitzar ISP a 83 °C i vam obtenir una mescla de productes. Finalment es va fer la hidròlisi en DCM a temperatura ambient i es va obtenir la hidroxilamina lliure però amb uns rendiments molt baixos. Degut als problemes obtinguts en condicions àcides, vam provar de fer la hidròlisi en condicions bàsiques utilitzant una solució aquosa de LiOH. Utilitzant aquestes condicions també obteníem una mescla de productes; el producte desitjat, la imina i un producte d¿addició. El que creiem que passa és que en obtenir la hidroxilamina i la imina, la N-alquilhidroxilamina actua com a nucleòfil i ataca al carboni del grup imina generant un producte d¿addició (veure l¿esquema 2). Els productes obtinguts eren molt difícils de separar. Esquema 2. Hidròlisi en condicions bàsiques utilitzant LiOH Finalment vam decidir canviar l¿estratègia per obtenir les N-alquilhidroxilamines i utilitzar l¿aminació reductiva, on el grup carbonil es converteix en una amina a través d¿una imina intermediària. El producte de partida són els aldehids, que es tracten amb una solució de liti perclorat-dietil èter (LPDE) 5.0 M amb O-trimetilsililhidroxilamina i s¿agita durant 10 min. A continuació, s¿afegeix el clorur de trimetilsilil i després de 10 min s¿addiciona el complex de borà/TEA i es deixa reaccionar durant 1-2 h, obtenint la N-alquil-O-trimetilsililhidroxilamina. Per obtenir la hidroxilamina lliure s¿addiciona una solució aquosa de NaHCO3 saturat. En portar a terme la reacció es van obtenir uns rendiments molt baixos. Per això, les condicions de la reacció van ser optimitzades, augmentant el nombre d¿equivalents dels reactius i el temps de reacció, per millorar el rendiment de la reacció. Finalment, tota la síntesi de N-hidroxilamines es va realitzar deixant reaccionar l¿aldehid (1eq), l¿O-trimetilsililhidroxilamina (1.5 eq) i el clorur de trimetilsilil (1.5 eq) durant 8 h, i un cop s¿addicionava el complex de borà/TEA (1.5 eq) la reacció es deixava reaccionant tota la nit. Es va sintetitzar una petita llibreria de N-alquilhidroxilamines i també es van comprar altres compostos que estaven disponibles comercialment, com per exemple la N-tert-butilhidroxilamina, la N-benzilhidroxilamina i la N-ciclohexilhidroxilamina. A més a més, en fer la reacció, dues oximes intermediàries no es van reduir per culpa d¿un efecte de conjugació entre l¿anell aromàtic i el doble enllaç de l¿oxima. La síntesi optimitzada de les N-alquilhidroxilamines i oximes va donar uns rendiments entre el 10 i el 70 %. Aquestes oximes juntament amb una altra disponible comercialment, l¿etil (2Z)-ciano(hidroxiimino)etanoat, van ser introduïdes a la llibreria. També la N,N-dietillhidroxilamina, HOAt i HOBt, que són amines secundàries, i N-hidroxibutiramide, un àcid hidroxàmic, van ser comprats i introduïts a la llibreria (veure figura 2). Tots aquests compostos donaran informació addicional sobre si les oximes, les amines secundàries, les amides i els àcids hidroxàmics poden inhibir o no l¿enzim RNR, o pel contrari, si l¿activitat inhibitòria de l¿enzim RNR serà específic de les amines primàries. Figura 2. Llibreria d¿hidroxilamines primàries, hidroxilamines secundàries, oximes, amides i àcids hidroxàmics. La llibreria composta per àcids hidroxàmics (RCONHOH), N-hidroxilamines (RNHOH), oximes (RHC=NOH), hidroxilamines secundàries (RNR¿OH) i amides (RNHCOR¿) va ser avaluada en quatre línies bacterianes diferents: P. aeruginosa, S. aureus, B. cenocepacia i B. anthracis; que són els patògens més comuns causants d¿infeccions oportunistes en pacients que pateixen malalties respiratòries. L¿avaluació biològica dels compostos va ser realitzada pel grup de l¿Eduard Torrents de l¿IBEC. Primer de tot, es va determinar la mínima concentració inhibitòria (MIC) dels compostos en les quatre línies de cèl¿lules en cultiu líquid. Es van identificar diversos compostos amb activitat antibacteriana. Els compostos més prometedors són els compostos 1, 7, 12, 13, 14 i 16, ja que tots ells presenten activitat antiproliferativa en B. anthracis, S. aureus i P. aeruginosa. El compost 15 presenta activitat antiproliferativa en B. anthracis i P. aeruginosa. En canvi, cap dels compostos sintetitzats són actius en B. cenocepacia. Tots els compostos que presenten activitat antibacteriana són hidroxilamines primàries, només el compost 16, que és una oxima, presenta la mateixa activitat. A més a més, alguns dels compostos van ser avaluats en la seva capacitat d¿inhibir la formació de biofilm. En aquest cas els compostos 1, 7, 12 i 14 van ser incubats en P. aeruginosa i els compostos 7, 12 i 14 amb S. aureus durant 48 h a diferents concentracions. Tots els compostos a 0.0625 mM inhibien la formació de P. aeruginosa i S. aureus biofilm en un 99 %, i a concentracions superiors la inhibició era total. Un cop sabíem que els compostos podien inhibir la formació de biofilm, també volíem saber si podien inhibir el biofilm un cop ja estava format. Per això, primer de tot es va procedir a la formació de biofilm de P. aeruginosa i S. aureus. Un cop els biofilms estaven format es van afegir els compostos a diferents concentracions i a diferents temps d¿incubació. El compost 7 a 0.125 mM durant 48 h era capaç d¿inhibir el biofilm de P. aeruginosa. Els compostos 1 i 13 presentaven activitat per inhibir el biofilm format de S. aureus. Com més augmentava la concentració i el temps d¿incubació més gran era la seva activitat de reduir el biofilm format. Finalment, es va avaluar la citotoxicitat dels compostos que presentaven activitat antibacteriana, ja que volíem estar segurs que aquests compostos inhibien l¿enzim RNR bacterià i no l¿humà. Per tant, la línia cel¿lular de macròfags murin J774 va ser incubada amb els compostos a diferents concentracions durant 24 i 48 h a 37 °C en una atmosfera humida al 5 % CO2. A continuació, es va determinar la viabilitat cel¿lular mitjançant un assaig colorimètric (MTT) (veure taula 1). Compound Cytoxicity (IC50) mM 1 1.89 2 >4 7 1.33 12 1.30 13 2.07 14 2.27 15 2.18 16 >4 19 >4 M-HA 3.2 Taula 1. Avaluació citotòxica dels compostos en una línia cel¿lular de macròfags Les concentracions citotòxiques són més altes que les concentracions que presenten activitat inhibidora de la formació de biofilm o inhibició del biofilm format. Per tant, aquests inhibidors amb activitat antibacteriana podran ser utilitzats com a medicaments en malalties respiratòries infeccioses cròniques com són la fibrosi quística, la malaltia pulmonar obstructiva crònica, bronquièctasis, granulomatosa crònica, i també en pacients que pateixen immunodeficiència o cremades cròniques. Capítol 2 La mitofusina 2 (Mfn2) és una proteïna mitocondrial que participa en la fusió mitocondrial i regula el metabolisme mitocondrial. El grup del Dr. Antonio Zorzano ha demostrat que la proteïna Mfn2 està disminuïda en el múscul de pacients que pateixen obesitat o diabetis de tipus 2, i recentment han demostrat que la deficiència de Mfn2 en fetge o múscul produeix intolerància a la glucosa i resistència a la insulina en ratolins. Per tant, activadors de l¿expressió de Mfn2 es podrien utilitzar terapèuticament pel tractament de la diabetis de tipus 2 i l¿obesitat. L¿objectiu d¿aquest segon capítol s¿ha enfocat en trobar activadors específics de l¿expressió de Mfn2 portant a terme un cribratge d¿alt rendiment amb una llibreria de compostos. Els possibles activadors han de ser validats a nivell cel¿lular i el seu mecanisme d¿acció ha de ser identificat. Per portar a terme aquest objectiu, es van generar diferents clons de cèl¿lules HeLa que expressen de forma estable la proteïna luciferasa sota el control de 2 Kb (regió -1982/+54) del promotor humà de Mfn2. Es van generar 57 clons i es va dur a terme l¿assaig luciferasa. A continuació, es van seleccionar 10 clons representatius de tots els clons generats, amb una activitat transcripcional del promotor humà de Mfn2 de rang alt i baix. El promotor humà de Mfn2 respon a l¿àcid 9-cis-retinoic (9-RA), el qual s¿utilitza com a control positiu, ja que genera la proteïna luciferasa. Per validar els 10 clons seleccionats, aquests es van incubar amb 9-RA i es va mesurar la seva activitat transcripcional. Tots els clons tractats amb 9-RA mostraven una activitat transcripcional més gran respecte al control. Els clons 3, 14 i 19 van ser seleccionats, ja que eren els clons que presentaven una activitat transcripcional més gran respecte el control quan eren incubats amb 9-RA. A més, aquests tres clons van ser transfectats amb un plasmid que codifica per PGC-1ß, que és un coactivador de receptors nuclears que controla la transcripció de Mfn2, mitjançant la coactivació del receptor nuclear ERR¿. El clon 14 va ser l¿únic que augmentava l¿activitat transcripcional del promotor de Mfn2 al ser transfectat amb PGC-1ß. Per tant el clon 14 (Mfn2P 14) va ser seleccionat per portar a terme el cribratge d¿alt rendiment amb la llibreria Prestwick. Aquesta llibreria conté 1120 compostos que estan aprovats per l¿agència Food and Drug Administration (FDA). El cribratge d¿alt rendiment es va realitzar amb la col¿laboració de la Dra. Mabel Loza a la Unitat d¿avaluació d¿activitats farmacològiques de compostos químics (USEF) a la Universitat de Santiago de Compostel¿la. Per dur a terme el cribratge d¿alt rendiment, primer de tot es va miniaturitzar el sistema per poder realitzar el cribratge en plaques de 96 pous. L¿assaig luciferasa es va validar i optimitzar en plaques de 96 pous utilitzant les cèl¿lules Mfn2P 14. El senyal de la luciferasa mitjançant el seu substrat, la luciferina, va ser avaluat amb el temps. A més a més, també es va avaluar el soroll de fons i la dispersió de dades. Es va decidir mesurar l¿activitat luciferasa 5 min després de l¿addició de la luciferina, ja que eren les condicions que proporcionaven els millors resultats per mesurar l¿activitat luciferasa. Les cèl¿lules Mfn2P 14 van ser sembrades en plaques de 96 pous (20.000 cèl/pou) i l¿endemà van ser incubades amb els compostos (10 µM) durant 16 h. A més a més, es va utilitzar 9-RA (10 µM) com a control positiu i 1% de DMSO, utilitzat com a vehicle pels compostos, com a control negatiu. Es va definir com a possible activador del promotor de Mfn2 aquells compostos que tinguessin una activitat luciferasa més gran del 60% respecte el 9-RA, el qual es va considerar que tenia una activitat del 100%. Els possibles activadors obtinguts del primer cribratge van ser confirmats en un assaig independent, i finalment 12 compostos van ser seleccionats com a possibles activadors del promotor humà de Mfn2. Aquests possibles 12 activadors del promotor de Mfn2 es van comprar comercialment i es van repetir els assaigs luciferasa per triplicat en plaques de 24 pous (90.000 cel/pou) al nostre laboratori. Set dels dotze compostos van ser seleccionats, ja que donaven millor activitat transcripcional i reproductibilitat. A continuació, es van fer les corbes dosi resposta dels compostos en les cèl¿lules Mfn2P 14 i es va obtenir la concentració òptima per obtenir la màxima activitat transcripcional del promotor de Mfn2. Per validar els compostos a nivell cel¿lular els set compostos seleccionats van ser incubats amb les concentracions òptimes en cèl¿lules HeLa, les quals contenen el promotor de Mfn2 endogen. Seguidament, es van mesurar els nivells d¿ARN missatger i de proteïna Mfn2. Únicament el compost 6, anomenat leflunomida, va ser capaç d¿incrementar els nivells d¿expressió de Mfn2. Es va tornar a intentar optimitzar la concentració de leflunomida i les cèl¿lules HeLa van ser incubades a diferents concentracions de leflunomida a diferents temps. Els nivells d¿ARN missatger de Mfn2 van ser mesurats i les millors condicions que proporcionaven els millors resultats eren utilitzant la leflunomida a 50 µM durant 48 h. La leflunomida, que comercialment és coneguda com a Arava, és un medicament utilitzat per l¿artritis reumatoide que va ser comercialitzat als Estats Units el 1998. La leflunomida quan és ingerida es converteix en teriflunomida, que és el metabòlit actiu. Aquesta reacció té lloc en el plasma i la mucosa intestinal (veure esquema 1). Esquema 1. La leflunomida es converteix en teriflunomida en el cos. Per tant, volíem estar segurs que la teriflunomida presentava la mateixa activitat que la leflunomida. La teriflunomida va ser capaç d¿incrementar els nivells d¿activitat transcripcional del promotor de Mfn2 i, a més a més, també incrementava els nivells d¿ARN missatger de Mfn2 en cèl¿lules HeLa. Tenint en compte aquests resultats, es va concloure que la teriflunomida presentava la mateixa activitat que la leflunomida i es va seguir treballant amb la leflunomida. La leflunomida havia estat validada en cèl¿lules HeLa, però per estar segurs de la seva activitat va ser validada en les cèl¿lules C2C12, on també va incrementar els nivells d¿ARN missatger i de proteïna de Mfn2. La leflunomida ha estat descrita com un inhibidor específic de l¿enzim dihidroorotat deshidrogenasa (DHODH). Aquest enzim catalitza la quarta reacció de la síntesi de novo de pirimidines. L¿enzim DHODH està localitzat a la membrana mitocondrial interna i catalitza l¿oxidació del dihidroorotat a orotat utilitzant ubiquinona com a acceptor d¿electrons. La leflunomida inhibeix l¿enzim unint-se en el lloc d¿unió de la ubiquinona, i d¿aquesta manera evita la producció de la uridina monofosfat (UMP). A partir de l¿UMP deriven altres nucleòtids del grup pirimidina, els quals són precursors importants utilitzats en ADN (timina i citosina), en ARN (uracil i citosina), en glicoproteïnes i en la biosíntesi de fosfolípids. Les bases pirimidíniques són essencials pel metabolisme i el creixement cel¿lular. La leflunomida i la teriflunomida produeixen efectes antiproliferatius en les cèl¿lules HeLa i C2C12 a través de la inhibició de l¿enzim DHODH, que causa la disminució de la síntesi de pirimidines. L¿addició d¿uridina, que en les cèl¿lules és metabolitzada a uridina monofosfat (UMP), la qual és un prerequisit per a la formació de pirimidines difosfat i trifosfat, reverteix la deficiència de la síntesi de pirimidines. Per tant, la uridina evita l¿efecte antiproliferatiu provocat per la leflunomida i el seu metabòlit actiu. Figura 1. La uridina bloqueja l¿efecte antiproliferatiu induït per la leflunomida i la teriflunomida en les cèl¿lules HeLa. A més, l¿addició d¿uridina en cèl¿lules HeLa tractades amb leflunomida o teriflunomida bloqueja l¿increment dels nivells d¿ARN missatger de Mfn2. Aquests resultats suggereixen que l¿augment de Mfn2 és provocat per la deficiència en la síntesi de pirimidines, indicant que el mecanisme d¿acció d¿aquests compostos està relacionat amb la inhibició de l¿enzim DHODH. Per tal d¿elucidar l¿efecte de la leflunomida en la fusió i la fissió mitocondrial, altres proteïnes de membrana mitocondrial involucrades en fusió, com per exemple la proteïna Mfn1 i OPA1, i involucrades en fissió, com per exemple Drp1 i Fis 1, van ser mesurades. La leflunomida i la teriflunomida augmenten els nivells d¿ARN missatger de Mfn1, però no es veuen canvis en els nivells d¿ARN missatger d¿OPA1 i de Drp1. L¿addició d¿uridina reverteix l¿increment de Mfn2. A més, la leflunomida indueix l¿expressió de la proteïna Mfn1 i disminueix la proteïna Drp1 en les cèl¿lules HeLa i C2C12. OPA1 disminueix en les cèl¿lules HeLa, encara que aquesta disminució no és evident en les cèl¿lules C2C12, i no es veuen canvis en els nivells de proteïna de Fis1. L¿addició d¿uridina en les cèl¿lules C2C12 tractades amb leflunomida evita l¿increment de les proteïnes Mfn2 i Mfn1. Aquests resultats suggereixen que la leflunomida o teriflunomida, causen una deficiència en la síntesi de pirimidines a través de la inhibició de l¿enzim DHODH, i augmenten l¿expressió de les proteïnes Mfn2 i Mfn1. L¿addició d¿uridina, que reverteix la deficiència de pirimidines, evita l¿augment de les mitofusines. Aquests resultats suggereixen un desplaçament del balanç entre fusió i fissió cap a fusió mitocondrial induint un increment de la longitud dels filaments mitocondrials quan les cèl¿lules estan exposades a una deficiència de pirimidines. Per observar els filaments mitocondrials de les cèl¿lules es van utilitzar les cèl¿lules HeLa i C2C12 que expressen de forma estable la proteïna mtDsRed, les quals van ser incubades amb leflunomida. Les cèl¿lules HeLa van ser fixades i visualitzades al microscopi confocal. En canvi, les cèl¿lules C2C12 van ser visualitzades in vivo utilitzant el microscopi confocal ¿spinning disk¿ (veure figura 2). A) Cèl¿lules HeLa B) Cèl¿lules C2C12 Ct Lef Figura 2. Imatges representatives de la morfologia mitocondrial en cèl¿lules HeLa i C2C12 que expressen de forma estable la proteïna mtDsRed incubades amb leflunomida. La leflunomida indueix un increment de la longitud dels filaments mitocondrials en les cèl¿lules HeLa i C2C12. Aquesta elongació de la xarxa mitocondrial s¿explica per una marcada inducció dels nivells de proteïna de fusió mitocondrial Mfn2 i Mfn1, i una disminució dels nivells de la proteïna de fissió Drp1. Un cop sabem que la leflunomida modula les proteïnes mitocondrials involucrades en la dinàmica mitocondrial produint l¿elongació de les mitocòndries, també volíem saber si afectava la funció mitocondrial en les cèl¿lules C2C12. Per això es va mesurar el potencial de membrana i el consum d¿oxigen. La leflunomida augmenta el potencial de membrana, i reprimeix de forma moderada la respiració mitocondrial màxima, després d¿afegir FCCP (veure figura 3). Figura 3. El consum d¿oxigen mitocondrial (OCR) va ser mesurat en les cèl¿lules C2C12 incubades amb leflunomida. La fusió mitocondrial consisteix en dos processos on la membrana interna i l¿externa es fusionen de forma separada. El mecanisme de fusió depèn de les proteïnes de membrana mitocondrials externes, que són la Mfn2 i la Mfn1, i de la proteïna de membrana mitocondrial interna OPA1. Nosaltres volíem saber si l¿efecte de la leflunomida depenia dels components claus de la maquinària de fusió mitocondrial, per això, es van utilitzar les cèl¿lules MEFwt, MEF Mfn2-/- i MEF Mfn1-/-. La leflunomida incrementa els nivells de Mfn2, Mfn1 i OPA1 en totes les cèl¿lules MEFs i no es veuen canvis en els nivells de proteïna de Drp1. A més a més, es va procedir a l¿observació dels filaments mitocondrials en aquestes cèl¿lules. Per dur a terme la visualització, es van utilitzar les cèl¿lules MEFwt, MEF Mfn2-/- i MEF Mfn1-/- que expressen de forma estable la proteïna mtDsRed i es van visualitzar in vivo en el microscopi confocal spinning disk o en el microscopi confocal ScanR/TIRF. Les cèl¿lules MEFwt presenten dues morfologies mitocondrials diferents. La classe majoritària està caracteritzada per una xarxa d¿extensos túbuls distribuïts al voltant del nucli, sense o amb poques mitocòndries esfèriques, mentre que la classe minoritària conté mitocòndries esfèriques. La leflunomida causa un allargament de les mitocòndries en la majoria de les cèl¿lules, i el nombre de mitocòndries fragmentades disminueix (veure figura 4). La pèrdua de Mfn1 o Mfn2 en les cèl¿lules MEFwt provoca fragmentació mitocondrial. La diferència entre la pèrdua de Mfn1 i Mfn2, és que la pèrdua de Mfn1 provoca una fragmentació més gran produint petites esferes mitocondrials de mida uniforme, mentre que, la pèrdua de Mfn2 produeix esferes de mides variables i túbuls mitocondrials. Les cèl¿lules MEF deficients en Mfn2 tenen tres tipus de poblacions diferenciades: cèl¿lules amb mitocòndries esfèriques (10%), cèl¿lules amb mitocòndries esfèriques i túbuls d¿una llargada màxima de 9 µm (82%) i cèl¿lules amb una xarxa mitocondrial allargada que conté túbuls més llargs de 9 µM (8 %). La leflunomida incrementa el número de cèl¿lules que contenen una xarxa mitocondrial allargada del 8 al 53 % de la població (veure figura 4). Les cèl¿lules MEF deficients en Mfn1 també presenten tres tipus de poblacions diferents: les cèl¿lules amb mitocòndries esfèriques (88 %), les cèl¿lules amb túbuls curts d¿una llargada màxima de 5 µm (12 %) i una població molt més petita (1 %) que conté túbuls mitocondrials d¿una llargada màxima de 5 µm. La leflunomida augmenta el número de cèl¿lules que contenen els túbuls mitocondrials curts del 12 al 34 %, però no és capaç d¿allargar els túbuls mitocondrials en les cèl¿lules MEF Mfn1-/- tant com en les MEF Mfn2-/- (veure figura 4). Figura 4. Imatges representatives de la morfologia mitocondrial en cèl¿lules MEFwt, MEF Mfn2-/- i MEF Mfn1-/- que expressen de forma estable la proteïna mtDsRed incubades amb leflunomida. La leflunomida promou l¿allargament de les mitocòndries en totes les cèl¿lules MEFs, encara que, l¿elongació mitocondrial depèn més de Mfn1 que de Mfn2 a causa de l¿allargament més gran de les cèl¿lules MEF Mfn2-/- comparat amb les cèl¿lules MEF Mfn1-/-. Aquest resultat indica que Mfn1 exerceix un rol més important en l¿elongació mitocondrial. La leflunomida produeix efectes antiproliferatius en les cèl¿lules MEFwt, MEF Mfn2-/- i MEF Mfn1-/- a través de la inhibició de l¿enzim DHODH, que causa la disminució de la síntesi de pirimidines. L¿addició d¿uridina, que en les cèl¿lules és metabolitzada a uridina monofosfat (UMP), reverteix la deficiència de la síntesi de pirimidines i evita parcialment l¿efecte antiproliferatiu provocat per la leflunomida, ja que la recuperació no és total com en el cas de les cèl¿lules HeLa i C2C12. Aquests resultats suggereixen que les cèl¿lules MEFs són més sensibles a la deficiència de pirimidines que les cèl¿lules HeLa o C2C12. A continuació, la funció mitocondrial en les cèl¿lules MEFwt, MEF Mfn2-/- i MEF Mfn1-/- va ser mesurada, ja que volíem saber si els efectes de la leflunomida en la funció mitocondrial depenia de l¿expressió de Mfn2 o de Mfn1. La leflunomida augmenta el potencial de membrana en totes les cèl¿lules MEFs i reprimeix la respiració mitocondrial en les cèl¿lules MEFs, més que en les cèl¿lules C2C12. En les cèl¿lules MEFs s¿observa menys consum d¿oxigen en la situació de rutina, en la situació de leak i també en la capacitat respiratòria màxima. A més a més, a partir dels valors de consum d¿oxigen mitocondrial es van calcular els ¿Flux Control Ratios¿, que ens donen informació sobre el grau d¿acoblament de la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa. La Respiratory Control Ratio (RCR = E/L) té tendència a augmentar en les cèl¿lules MEFwt i MEF Mfn1-/- tractades amb leflunomida, indicant que la cadena de transport electrònic i la fosforilació oxidativa estan més acoblades. En canvi, la ¿Phosphorylation Respiratory Control Ratio¿ (RCRp = (R-L)/E) té tendència a disminuir en les cèl¿lules MEFs incubades amb leflunomida, indicant que el percentatge de la capacitat respiratòria màxima que utilitzen les cèl¿lules lligat a la producció d¿ATP és inferior. Anteriorment s¿ha explicat que l¿enzim DHODH, localitzat en la membrana mitocondrial interna, catalitza la quarta reacció de la síntesi de pirimidines, que consisteix en l¿oxidació del dihidroorotat en orotat utilitzant la ubiquinona com a cosubstrat i acceptor d¿electrons. Seguidament, la ubiquinona al acceptar el parell d¿electrons és convertida en ubiquinol, que és el substrat del complex III de la cadena respiratòria. Per tant, la síntesi de novo de pirimidines està acoblada a la cadena respiratòria mitocondrial. Per això, creiem que la disfunció de la cadena respiratòria a través del complex IIII, inhibiria indirectament l¿enzim DHODH causant una deficiència de la síntesi de pirimidines, i com a conseqüència produiria un allargament de les mitocòndries igual que passa amb el compost leflunomida. Per comprovar aquesta hipòtesi, dos inhibidors específics del complex III, mixotiazol i antimicina A, van ser emprats. Primer de tot es van fer estudis de concentració i de temps d¿incubació pels dos compostos, per obtenir la concentració òptima que produeix el màxim increment en els nivells d¿ARN missatger de Mfn2 en cèl¿lules HeLa. Les millors condicions obtingudes per mixotiazol són una concentració de 2 µM i un temps d¿incubació de 24 h i per antimicina A la concentració òptima és 10 µM i un temps d¿incubació de 24 h en cèl¿lules HeLa. Aquestes condicions van ser validades, ja que augmentaven els nivells de proteïna de Mfn2 en cèl¿lules HeLa. D¿altra banda, els compostos produeixen efectes antiproliferatius en les cèl¿lules HeLa i C2C12. Així, estem segurs que els inhibidors de complex III, indirectament inhibint l¿enzim DHODH, inhibeixen també la síntesi de pirimidines. A més, es van mesurar els nivells d¿ARN missatger de Mfn2, Mfn1, OPA1 i Drp1 de les cèl¿lules HeLa tractades amb mixotiazol o antimicina A en presència o absència d¿uridina. L ¿addició d¿uridina evita l¿increment d¿expressió gènica de Mfn2 induïda per mixotiazol i antimicin A. Aquests resultats confirmen que l¿augment d¿expressió de Mfn2 és desencadenada per la deficiència de pirimidines. Mixotiazol tendeix a augmentar els nivells d¿ARN missatger de Mfn1 i a disminuir els d¿OPA1, mentre que els nivells de Drp1 no varien. L¿antimicina A tendeix a augmentar els nivells d¿ARN missatger de Mfn1 i de Drp1, mentre que els nivells d¿OPA1 no varien. En ambdós casos, l¿addició d¿uridina reverteix aquestes tendències. El següent pas va ser analitzar els nivells de les proteïnes mitocondrials involucrades en els mecanismes de fusió i fissió en cèl¿lules HeLa. Així es va trobar que mixotiazol incrementava els nivells de proteïna de Mfn1, i disminuïa els d¿OPA1, mentre que Drp1 no variava. Aquests resultats suggereixen que mixotiazol podria induir l¿allargament de les mitocòndries, ja que augmenta els nivells de les proteïnes Mfn2 i Mfn1. En canvi, antimicina A presenta una tendència a disminuir els nivells de proteïna de Drp1, però Mfn1 no varia. Els nivells d¿OPA1 no varien però sí que s¿observa una variació de les bandes. OPA1 és una proteïna mitocondrial interna que participa en la fusió de la membrana interna de les mitocòndries i presenta 8 isoformes diferents. Les isoformes llargues activen la fusió mitocondrial interaccionant amb les mitofusines, i les isoformes curtes detenen la fusió i generen fragments mitocondrials. L¿apoptosi provoca que OPA1 s¿alliberi en el citosol, on les isoformes llargues són proteolíticament processades a isoformes curtes i les mitocòndries són fragmentades. L¿antimicin A produeix un canvi de les isoformes d¿OPA1, passant de les formes llargues a les curtes. Aquests resultats suggereixen que l¿antimicina A provoca fragmentació mitocondrial. Per observar els filaments mitocondrials de les cèl¿lules es van utilitzar les cèl¿lules HeLa mtDsRed, les quals van ser incubades amb mixotiazol i antimicin A. Les cèl¿lules HeLa mtDsRed van ser fixades i visualitzades al microscopi confocal. Figura 5. Imatges representatives de la morfologia mitocondrial en cèl¿lules HeLa mtDsRed incubades amb mixotiazol i antimicin A. Les cèl¿lules HeLa mtDsRed incubades amb mixotiazol mostren una xarxa mitocondrial allargada comparades amb les cèl¿lules control. Aquests resultats demostren que el mixotiazol incrementa l¿expressió de les mitofusines i promou l¿elongació de les mitocòndries. Al contrari, antimicina A causa fragmentació mitocondrial. Aquests resultats suggereixen que l¿antimicina A accelera el procés proteolític de les isoformes llargues d¿OPA1 a les isoformes curtes, inactivant OPA1 i produint fragmentació mitocondrial. Per tant, es va decidir descartar l¿antimicina A i continuar amb mixotiazol. El mixotiazol va ser validat en una altra línia cel¿lular, en les cèl¿lules C2C12. Però en aquest cas per obtenir un increment dels nivells de proteïna de Mfn2, mixotiazol s¿havia d¿incubar a una concentració 2 µM durant 12 h. Les cèl¿lules C2C12 incubades amb mixotiazol durant 24 h presentaven apoptosis i fragmentació mitocondrial. Mixotiazol augmenta els nivells de les proteïnes Mfn2, Mfn1 i OPA1, les quals estan involucrades en fusió mitocondrial. En canvi, disminueix els nivells de proteïna Drp1, que està involucrada en fissió mitocondrial. La visualització de les cèl¿lules C2C12 mtDsRed es va realitzar in vivo (veure figura 6). Figura 6. Imatges representatives de la morfologia mitocondrial en cèl¿lules C2C12 mtDsRed incubades amb mixotiazol. Les mitocòndries de les cèl¿lules C2C12 mtDsRed incubades amb mixotiazol estan allargades respecte al control. A més, la morfologia mitocondrial de les cèl¿lules MEFwt mtDsRed incubades amb mixotiazol a 2 µM durant 12 h també va ser visualitzada (veure figura 7). Figura 7. Imatges representatives de la morfologia mitocondrial en cèl¿lules MEFwt mtDsRed incubades amb mixotiazol. Les cèl¿lules MEFwt mtDsRed incubades amb mixotiazol mostren una xarxa mitocondrial allargada comparada amb les cèl¿lules control. Aquests resultats demostren que el mixotiazol incrementa l¿expressió de les mitofusines i promou l¿elongació de les mitocòndries en les cèl¿lules HeLa, C2C12 i MEFwt. Per tant, podem concloure que el mixotiazol i la leflunomida inhibint la síntesi de pirimidines, modulen les proteïnes mitocondrials involucrades en la dinàmica mitocondrial i promouen l¿elongació mitocondrial. Els inhibidors de la síntesi de pirimidines produeixen un bloqueig de la via depenent de p53. Ha estat descrit que l¿absència de la síntesi d¿ADN en fibroblast produeix una parada del cicle cel¿lular a la fase G1/S depenent de p53. La disminució de CTP, GTP, o UTP és suficient per produir una parada del cicle, depenent de p53. L¿addició d¿uridina, impedeix l¿increment de l¿expressió de p53. S¿ha suggerit que p53 pot mantenir l¿estabilitat genètica prevenint la replicació d¿ADN durant la deficiència de pirimidines. A més a més, s¿ha descrit que la inhibició específica del complex III de la cadena respiratòria, però no la inhibició de la cadena respiratòria per se, produeix una inducció de p53. Així doncs, el desacoblament produït entre l¿enzim DHODH i el complex III produeix una resposta de p53. La nostra hipòtesi és que la deficiència de pirimidines, per causa dels inhibidors de l¿enzim DHODH o del complex III, causa estrès cel¿lular i desencadena l¿activació de p53. p53 modularia les proteïnes mitocondrials involucrades en fusió i fissió i promouria l¿elongació de les mitocòndries com a resposta a aquest estrès (veure esquema 2). Esquema 2. La síntesi de pirimidines està vinculat a la via de p53. La leflunomida i la teriflunomida disminueixen la síntesi de pirimidines inhibint l¿enzim DHODH i augmenten l¿expressió gènica de p53. L¿addició d¿uridina, que reverteix la deficiència de pirimidines, impedeix l¿augment d¿ARN missatger de p53. A més a més, la leflunomida augmenta els nivells de la proteïna p53 en cèl¿lules HeLa. L¿increment de p53 també va ser confirmat en les cèl¿lules C2C12 incubades amb leflunomida, i l¿addició d¿uridina evitava aquest increment. Per tant, la deficiència de pirimidines causa un augment de l¿expressió de p53 que pot ser impedit per l¿addició d¿uridina, que restableix els nivells de les pirimidines. D¿altra banda volíem saber si aquest efecte també es produïa en les cèl¿lules MEFwt i en les cèl¿lules MEF deficients de Mfn2 o de Mfn1. Totes les cèl¿lules MEFs presenten un augment dels nivells de proteïna de p53 quan són incubades amb leflunomida, el qual és impedit per l¿addició externa d¿uridina. El mixotiazol, que disminueix la síntesi de pirimidines a través de la inhibició del complex III de la cadena respiratòria, també augmenta els nivells d¿expressió de p53 en cèl¿lules HeLa tant els nivells d¿ARN missatger com els de proteïna. L¿addició d¿uridina externa impedeix l¿augment de l¿expressió de p53. A més, l¿increment de l¿expressió de p53 per causa de mixotiazol també va ser validat en les cèl¿lules C2C12. Per tant, podem concloure que la deficiència de pirimidines, a causa dels inhibidors de l¿enzim DHODH o del complex III, leflunomida i mixotiazol, respectivament, indueixen l¿increment de l¿expressió de p53. La proteïna p53 juga un paper molt important en resposta al dany de l¿ADN i a la deficiència de pirimidines, ja que l¿activació de p53 pot concloure en parada de cicle cel¿lular i reparació de l¿ADN o en apoptosis. Els nivells de p53 estan controlats a través de la degradació del proteasoma. La MDM2 i altres lligases E3 inhibeixen l¿acumulació de p53, marcant p53 amb ubiqüitina per la seva posterior degradació pel proteasoma 26S. Aquest procés pot ser aturat per estrès, a través de la fosforilació de p53, o a través del increment de la proteïna inhibidora p14ARF. La fosforilació de p53 a la Ser15 o a la Ser20 disminueix la interacció entre p53 i el seu regulador negatiu, MDM2, atès que impedeix l¿habilitat de MDM2 d¿unir-se a p53, promovent l¿activació i l¿acumulació de p53. Tant les cèl¿lules HeLa com les cèl¿lules C2C12 presenten una forta activació de la Ser15 de p53 en tractar-les amb leflunomida o amb mixotiazol. A més a més, l¿addició d¿uridina que reverteix la deficiència en pirimidines és capaç d¿inhibir l¿activació de p53 a través de la Ser15. Per tant, podem concloure que la leflunomida i el mixotiazol promouen l¿activació i l¿acumulació de p53 a través de la fosforilació de la Ser15. Per estar segurs que p53 regula els gens mitocondrials involucrats en la dinàmica mitocondrial les cèl¿lules HeLa van ser transfectades temporalment amb un vector d¿expressió de p53 (CMVp53) o amb un vector buit utilitzat com a control negatiu (pcDNA3.1). Aquests experiments no van funcionar, ja que es va aconseguir molt poc increment de p53. Seguidament, es va reprimir l¿expressió de p53 utilitzant els ARN d¿interferència (siRNA). Les cèl¿lules HeLa van ser transfectades amb el siRNA de p53 (específic d¿humà) i el siRNA control que conté un conjugat de fluoresceïna per mesurar l¿eficiència de la transfecció. A continuació, les cèl¿lules van ser incubades amb leflunomida. Primer de tot es van mesurar els nivells d¿ARN missatger de p53 per estar segurs que els siRNA havien funcionat. Es veia una disminució de l¿expressió gènica de p53 en les cèl¿lules on p53 estava reprimida, i a més a més, leflunomida no tenia cap efecte en aquestes cèl¿lules. Els nivells d¿ARN missatger de Mfn2 en les cèl¿lules HeLa control incubades amb leflunomida augmentaven. En canvi, en les cèl¿lules on p53 està reprimida els nivells basals d¿ARN missatger de Mfn2 estaven augmentats respecte a les cèl¿lules control, però leflunomida no era capaç d¿augmentar l¿expressió gènica de Mfn2 en aquestes cèl¿lules. El següent pas va ser transfectar les cèl¿lules HeLa amb el siRNA de p53 i mesurar els nivells de la proteïna p53, per estar segurs de la seva reducció. En les cèl¿lules on p53 estava reprimida no es va observar senyal de p53 i a més a més els nivells de proteïna de Mfn2 estaven reduïts respecte al control. Figura 8. Els nivells de les proteïnes Mfn2 i p53 en les cèl¿lules HeLa transfectades temporalment amb el siRNA control i de p53. A continuació les cèl¿lules HeLa van ser transfectades amb el siRNA control i de p53 i incubades amb leflunomida. Les proteïnes Mfn2, Mfn1 i p53 augmenten en les cèl¿lules HeLa control incubades amb leflunomida. En canvi, en les cèl¿lules HeLa on p53 està reprimida I incubades amb leflunomida, no es veu senyal de p53 i no es veu augment de Mfn2, però sí que augmenta Mfn1. Els nivells basals de les proteïnes Mfn2 i Mfn1 estan augmentats respecte a les cèl¿lules HeLa control, igual que passa amb els nivells d¿ARN missatger de Mfn2. Aquests resultats suggereixen que la reducció de p53 augmenta els nivells basals de Mfn2 i Mfn1 en les cèl¿lules HeLa com a mecanisme d¿adaptació. Aquest mateix experiment es va realitzar en les cèl¿lules C2C12 (veure figura 9). Les proteïnes Mfn2, Mfn1 i p53 augmenten i Drp1 disminueix en les cèl¿lules C2C12 control incubades amb leflunomida. En canvi, en les cèl¿lules C2C12 on p53 està reprimida incubades amb leflunomida, no es veu senyal de p53 i no es veu augment de Mfn2, ni de Mfn1, encara que els nivells basals de Mfn1 estan augmentats respecte a les cèl¿lules C2C12 control. A més a més la disminució de Drp1 és inferior en aquestes cèl¿lules respecte al control. Aquests resultats suggereixen que la reducció de p53 en les cèl¿lules C2C12 augmenta els nivells basals de Mfn1 com a mecanisme d¿adaptació. Figura 9. Els nivells de Mfn2, Mfn1, Drp1 i p53 van ser determinats en les cèl¿lules C2C12 transfectades temporalment amb el siRNA control i de p53. Tenint en compte aquests resultats, podem suggerir que el mecanisme d¿acció a través del qual la leflunomida és capaç d¿incrementar els nivells d¿expressió de les mitofusines és a través de p53, ja que la reducció de p53 bloqueja l¿increment de les proteïnes Mfn2 i Mfn1 en resposta a leflunomida. A manera de conclusió, podem dir que la disminució de la síntesi de pirimidines a través de la inhibició del complex III o de l¿enzim DHODH, causa estrès cel¿lular i produeix l¿activació i l¿acumulació de p53 a través de la fosforilació de la Ser15, produint una parada del cicle cel¿lular. Nosaltres suggerim que p53 indueix l¿augment de l¿expressió de les mitofusines i la disminució de Drp1, provocant l¿elongació de les mitocòndries. L¿allargament de la xarxa mitocondrial proporciona més resistència a les cèl¿lules que pateixen un estrès cel¿lular. L¿addició d¿uridina reverteix la deficiència de la síntesi de pirimidines, impedint l¿efecte antiproliferatiu i l¿augment de p53 i de les Mfns en les cèl¿lules tractades amb leflunomida. Per tant, l¿elongació mitocondrial és una resposta adaptativa a l¿estrès cel¿lular que pateixen les cèl¿lules per causa de la leflunomida o el mixotiazol (veure esquema 3). Esquema 3. Leflunomida i mixotiazol produeixen elongació mitocondrial a través de l¿activació de p53.