Silenciament gènic de CD40 en al•lo i autoimmunitat. Estudi de la resposta immuno inflamatòria en models animals

• Autores: Elia Ripoll Llagostera
• Directores de la Tesis: Joan Torras Ambros (dir. tes.), Inmaculada Herrero Fresneda (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ricard Cervera Segura (presid.), Xavier Fulladosa (secret.), Georgina Hotter Corripio (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
    • Medicina interna
      • Nefrología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Tots els estudis presentats en aquest treball tenen com a objectiu ampliar el coneixement del gen CD40 i el seu paper en l’activació del sistema immune. Per estudiar aquesta funció es va aplicar un silenciament gènic mitjançant la tecnologia RNAi en models experimentals, tant in vitro com in vivo; en un model de malaltia autoimmune, com la nefritis lúpica, i un de malaltia al•loimmune, com és el cas del trasplantament renal. El senyal de coestimulació de CD40-CD40L juga un paper molt important en l’activació del sistema immunitari. En el cas del trasplantament renal se sap que CD40 juga un paper molt important en el reconeixement de l’al•loantigen i la inflamació provocada per la isquèmia reperfusió. En el cas de la nefropatia lúpica es dóna un reconeixement autoimmune que també inicia una cascada inflamatòria. La teràpia gènica contra CD40 permetrà un tractament més específic i eficient d’aquesta diana, amb una tecnologia d’aplicació futura probablement més efectiva que les teràpies convencionals. La teràpia gènica contra CD40 utilitzant la tecnologia de RNA interferència, permetria evitar la sobre activació del sistema immunitari tant en un context al•loimmune com autoimmune i controlar el dany inflamatori derivat. El nostre primer estudi es va proposar per a veure com afecta la isquèmia freda sobre la funció renal en un model de rebuig agut mediat per anticossos, veure com modifica l’estructura molecular, tissular i cel•lular de l’empelt renal. Analitzar també quin paper juga CD40 en aquest procés. No se saben en profunditat els mecanismes pels quals la isquèmia accelera el rebuig agut i preveu una pitjor evolució de l’empelt. Els nostres resultats apunten també cap a l’alteració de la barrera de filtració glomerular com a una causa important de deteriorament de l’empelt i la seva evolució. Es va poder comprovar que la isquèmia provocada en un procés de trasplantament renal augmenta la síntesis de col•lagen IV i el seu dipòsit en la capsula de Bowman. També provoca l’activació de la immunitat innata i augmenta l’expressió de CD40. Tots aquests mecanismes i els consecutius mediadors inflamatoris alliberats, indueixen una major amplificació del dany i activació de la resposta immune adaptativa, perpetuant així, el cicle de dany i reparació de l’empelt que podria donar lloc a la seva disfunció crònica. Un cop posat el model a punt i caracteritzat, tenint en compte el paper de la senyal coestimuladora CD40 en l’activació de la resposta immune; es va proposar un segon estudi on es va dissenyar un siRNA anti CD40 específic de rata. L’objectiu principal era estudiar el paper i el potencial terapèutic del fàrmac administrat de forma local, en un model de resposta de tipus al•logènica com és el cas del trasplantament renal. En aquest model en el qual l’administració del fàrmac era local intra-arterial, es va administrar el siRNA acomplexat amb un vector de tipus liposoma. En aquest estudi vam observar que el silenciament local intra-renal, previ al trasplantament, amb siRNA anti CD40 amb una dosis única en un model de rebuig humoral va causar un canvi de patró en el tipus de rebuig, es va aconseguir reduir els anticossos donant específics de l'hoste desprès del trasplantament i es va millorar la supervivència. El tractament local de l'òrgan aïllat va aconseguir bloquejar l’expressió gènica de CD40 a l’empelt, donant lloc a un canvi en l’ambient immunològic, els grups de silenciament de CD40 van experimentar un canvi de tipus de rebuig cap a un rebuig cel•lular, més fàcilment abordable des d’un punt de vista terapèutic. La histologia dels empelts del grup no tractat mostrava lesions típiques del rebuig humoral. La majoria dels empelts del grup de tractament amb siRNA anti CD40 mostraven un patró de rebuig cel•lular. Els animals no tractats tenien dipòsits de complement als capil•lars peritubulars, tant C4d com IgG, mentre que el grup de tractament amb siRNA anti CD40, aquests es van veure reduïts. Una altra evidència de la disminució de l’activació del sistema del complement, a conseqüència del silenciament de CD40, també va ser la reducció de l’expressió gènica de proteïnes reguladores de complement, com són CFH i CFI. Es va confirmar l’aparició d’anticossos donant específics a la majoria d’animals del grup no tractat, que eren absents prèviament al trasplantament, així doncs, hi ha una formació massiva d’aquests degut a una ràpida activació de les cèl•lules B, en el nostre estudi, aquest anticossos donant específic es van reduir parcialment en el grup de tractament amb rapamicina, siRNA anti CD40, i al grup de combinació de teràpia. Per tant en aquest treball es demostra que el silenciament de CD40 com a tractament local previ a la implantació de l’empelt renal és una estratègia efectiva i abordable per prevenir el rebuig humoral. Aquest resultats preliminars obren les portes a aplicar aquest tipus de teràpia gènica en altres models de trasplantament o altres malalties inflamatòries o autoimmunes on les cèl•lules B hi tinguin un paper important. Així doncs es va proposar un tercer treball l’objectiu del qual era analitzar el paper de CD40 en aquest model de nefritis lúpica, de caràcter autoimmune. Inicialment es va fer un estudi in vitro utilitzant un cultiu de cèl•lules dendrítiques derivades de moll d’os. Primer vam comparar l’entrada cel•lular del siRNA modificat químicament amb un siRNA nu sense modificar mitjançant citometria de flux; vam observar que ambdós molècules tenien un 100% d’entrada, però que el siRNA modificat tenia una MFI més elevada. Per microscòpia confocal vam confirmar una localització citoplasmàtica del siRNA i que l’entrada era rapida. Posteriorment es va estimular les cèl•lules dendrítiques amb LPS durant 12h i, un cop comprovat que l’estímul fos eficaç, vam observar que el siRNA anti CD40 era capaç d’inhibir de manera evident l’augment d’expressió de CD40 induït per LPS. Per conèixer millor l’eficiència de l’administració sistèmica del siRNA es va escollir un model amb ratolins ICR en el qual vam comprovar la cinètica d’expressió de CD40 després d’un estímul de LPS en diferents teixits. Vam observar que l’estímul de LPS induïa un augment de l’expressió de CD40, tenint un pic màxim passades 4h de la injecció del LPS, i que aquesta tornava a nivells basals en 24-48h. Un cop caracteritzada, es van fer grups de tractament amb el siRNA per valorar el potencial del fàrmac i vam observar que el siRNA era capaç de reduir significativament aquesta expressió durant tres o quatre dies Es va avaluar la biodistribució del compost injectant un siRNA marcat amb un fluorocrom (Cy5.5) a ratolins ICR i vam observar que la distribució del fàrmac a l’organisme era major en fetge, melsa i ronyó independentment de si l’administració era intravenosa o intraperitoneal, ja que no hi havia diferències entre aquestes. 30 minuts després de l’administració ja vam observar una internalització del siRNA a les cèl•lules dels teixits. Es va comprovar que en un teixit patològic, com és el cas d’un ronyó afectat per nefritis lúpica, la distribució del siRNA era semblant com en el cas d’un teixit sa, per tant, no hi ha diferències entre l’alliberament de la molècula en un teixit sa i patològic. Aquest resultats ens van permetre establir un protocol de tractament dels animals amb nefropatia lúpica, es va decidir administrar el siRNA intraperitonealment i dos cops per setmana. El model animal que es va escollir per l’experiment de nefritis lúpica va ser NZB/W F1, un dels models més utilitzats i ben establert experimentalment. En el nostre estudi, els resultats obtinguts van demostrar que el silenciament de CD40 en aquest model muri millora la supervivència i frena l’evolució de la malaltia. Clínicament s’observa una disminució de la proteïnúria, albuminúria i dels anticossos circulants anti dsDNA. A part del grup tractat amb ciclofosfamida, que és un control positiu de tractament, també es va incloure el CTLA4, com a control de bloqueig de coestimulació: Aquest últim tot i mostrar diversos graus d'activitat en diversos assajos, només va resultar ser tan potent com el tractament amb una dosi única setmanal de siRNA anti CD40 per aturar la progressió de la proteïnúria, clarament una dosi sub-terapèutica en comparació amb els efectes del tractament amb siRNA anti CD40 dos cops per setmana. També vam observar una millora de les lesions histològiques típiques de la malaltia, els grups de bloqueig de coestimulació van ser els més eficaços en prevenir les lesions histològiques, destacant el grup tractat amb siRNA dos cops per setmana on l’infiltrat intersticial, l’atròfia tubular, i l’infiltrat intersticial eren absents. També es va observar una reducció de la infiltració renal per cèl•lules T i cèl•lules que segreguen immunoglobulines. En la patologia de la nefritis lúpica se sap que el dany renal és iniciat amb els dipòsits glomerulars d’immunocomplexes, aquests juguen un paper molt important i són predominantment anticossos contra ssDNA, dsDNA, histones, proteïnes de complement, etc. Aquests immunocomplexes localitzats tant al mesangi com de forma subendotelial, contribueixen al reclutament de cèl•lules inflamatòries. En el nostre estudi vam observar que els ratolins no tractats tenien dipòsits d’immunoglobulina G en el parènquima renal, mentre que tots els tractaments aconseguien reduir-los, cal remarcar que els grups de tractament amb bloqueig de coestimulació van ser més efectius que el grup tractat amb CYP. L’anàlisi de l’expressió gènica de CD40 demostra, com era previsible, una disminució significativa en el parènquima renal. El silenciament de CD40 també va induir una disminució de citosines pro inflamatòries com és el cas de la IL6; gens relacionats amb l’inflammosoma es mostren elevats en el grup no tractat, mentre que en els grups de tractament estan disminuïts. Tot això suggereix també un efecte de modulació local de la resposta inflamatòria. Podem concloure que els nostres resultats evidencien el potencial terapèutic i els efectes del silenciament específic de CD40 mitjançant el siRNA com una forma de disminuir i modular l'activació del sistema immune en els ronyons inflamats, tant en el cas del trasplantament d’òrgans sòlids com en el cas de malalties autoimmunes.