Ca2+-ATPasa y Muerte Celular Inducida por Ca2+ en células Cardíacas H9c2
- Autores: Antonio Manuel Lax Pérez
- Directores de la Tesis: Francisco Fernández Belda (dir. tes.), Fernando Soler Pardo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Carmelo Gómez Fernández (presid.), Senena Corbalán García (secret.), Maria Paz Carrasco Jimenez (voc.), María Isabel Fortea (voc.), Ana Linares Gil (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
- Resumen
El plan de trabajo de esta Tesis Doctoral plantea dos objetivos generales: estudiar el fenómeno de desacoplamiento energético ocasionado durante la actuación de la enzima Ca2+-ATPasa de RS (SERCA) en determinadas condiciones experimentales; y la caracterización de procesos relacionados con alteraciones del Ca2+ intracelular que están implicados en la activación de muerte celular por apoptosis. La hidrólisis de ATP que se observa al poner vesículas de retículo sarcoplásmico (RS) en presencia de Mg2+ y ausencia de Ca2+ se debe a la actividad catalítica de la enzima Ca2+-ATPasa. La velocidad de hidrólisis de ATP medida a pH neutro y en presencia de Mg2+ 5 mM muestra una dependencia hiperbólica cuando se expresa en función de la concentración de ATP. La hidrólisis del sustrato ATP-Mg2+ se inhibe tanto por Mg2+ libre como por ATP libre pero no se ve afectada por la presencia de vanadato. La velocidad de hidrólisis del pseudo-sustrato pNPP en ausencia de Ca2+ no se altera por la presencia de análogos no hidrolizables de ATP. La afinidad de unión de ATP a la enzima a pH neutro y ausencia de Ca2+ aumenta con la concentración de Mg2+, pero disminuye con la de vanadato cuando Mg2+ está presente. Los resultados obtenidos indican que: (i) la unión de Ca2+ al enzima no es un requerimiento necesario para observar una hidrólisis lenta de ATP; (ii) la hidrólisis de ATP-Mg2+ en ausencia de Ca2+ requiere un cambio conformacional de la enzima que permita la aproximación de los dominios citosólicos; (iii) la actividad hidrolítica independiente de Ca2+ es importante cuando la concentración de Ca2+ en el citosol es muy baja -nivel basal o estado de reposo de la célula- o cuando la unión de Ca2+ a la enzima está bloqueada. Esta última situación está relacionada con el mecanismo de inhibición por tapsigargina (TG) y por otros muchos inhibidores de la enzima. La caracterización de depósitos intracelulares y flujos de Ca2+ en células H9c2 se ha realizado con ayuda de indicadores fluorescentes y compuestos que movilizan Ca2+. Vasopresina da lugar a un aumento transitorio de Ca2+ citosólico, siendo 6 nM la concentración que produce la mitad del efecto máximo mientras que 3 nM es la concentración de TG que produce la mitad del efecto máximo. La despolarización de la membrana interna mitocondrial mediante un protonóforo también ocasiona un aumento en el nivel de Ca2+ citosólico. El ionóforo ionomicina (IO) induce un pequeño descenso del m que se mantiene a lo largo del tiempo mientras que TG provoca un descenso pequeño que es transitorio. El depósito de Ca2+ sensible a TG es también sensible a IO mientras que el depósito sensible a protonóforo no lo es. El aumento transitorio del Ca2+ mitocondrial no se inhibe por ciclosporina A (CsA) cuando la descarga reversible del depósito del retículo sarco-endoplásmico (RSE) se produce mediante la adición de vasopresina. Sin embargo, el aumento transitorio del Ca2+ mitocondrial se inhibe por CsA cuando se produce una descarga irreversible del Ca2+ almacenado en el RSE mediante TG. Estas observaciones indican que la mitocondria es capaz de interpretar las señales de Ca2+ citosólico que se generan en el depósito intracelular del RSE. La adición de TG 10 M a células H9c2 produce un aumento transitorio de Ca2+ citosólico que tiene dos componentes. Experimentos realizados en un medio sin Ca2+ demuestran el origen intracelular de ambos componentes. El primer componente corresponde a salida de Ca2+ del RSE. El segundo componente está asociado a despolarización de la membrana interna mitocondrial y su aparición se evita al preincubar las células con CsA. Esto indica el origen mitocondrial de este componente y que la salida de Ca2+ de la mitocondria está relacionada con la apertura del poro de permeabilidad transitoria (PTP). El tratamiento con TG 10 M que da lugar a un aumento de Ca2+ citosólico con dos componentes produce muerte celular antes que cuando se trata con TG 3 M que origina solo el primer componente-. En ambos casos se observa fragmentación de cromatina y condensación en la periferia del núcleo. Pérdida de contenido en DNA y ruptura hidrolítica de poliADP-ribosa polimerasa son otras características observadas que son dependientes de la concentración de TG y que se producen en diferentes ventanas de tiempo. La muerte apoptótica inducida por TG 10 M se debe a apertura del PTP mitocondrial. El daño producido por TG 3 M ó tunicamicina (TM) 1 g/ml sobre el RS ocasiona la pérdida de viabilidad de la población celular en aproximadamente 72 h. La liberación de citocromo c (cit c) de la mitocondria ocurre inmediatamente después del daño siendo simultánea o posterior a la translocación de Bax a la mitocondria. La liberación de cit c no está relacionada con despolarización mitocondrial ni con activación de caspasas. El daño irreversible producido sobre el RS detectado por la activación de caspasa 12 en la fase inicial del proceso provoca la activación de la ruta apoptótica mitocondrial. La preincubación de células con un inhibidor selectivo para caspasa 8 ó caspasa 9 bloquea la proteolisis selectiva de caspasa 3 mientras que la preincubación con un inhibidor de caspasa 9 bloquea la activación de caspasa 8. Esto indica que caspasa 8 forma parte de un bucle de retroalimentación positiva que produce amplificación de la cascada de activación de caspasas. La inhibición de caspasas con un inhibidor general no protege de la muerte celular lo que sugiere la existencia de mecanismos alternativos de muerte que no son dependientes de caspasas. La adición de TG 10 M a células H9c2 produce liberación de cit c de la mitocondria que está asociada a una rápida disminución del m. En cambio, la liberación de cit c inducida por estaurosporina (ST) 50 nM está mediada por la activación de Bax sin que se altere el m. La acumulación de cit c en el citosol alcanza niveles similares en ambos casos, lo que indica que la magnitud de la liberación es independiente del mecanismo de permeabilización de la membrana externa mitocondrial. Cualquiera de los dos inductores de apoptosis produce activación de caspasa 9 caspasa iniciadora y caspasa 3 caspasa efectora así como del bucle de amplificación de la fase ejecutora de la apoptosis en el que interviene caspasa 8. La liberación de cit c que produce alteración funcional de la mitocondria se produce antes cuando se induce con TG 10 M que con ST 50 nM. Sin embargo, las alteraciones morfológicas de la célula y la condensación de cromatina se desarrollan antes cuando se incuba con ST 50 nM. El inhibidor general de caspasas no protege de la condensación de cromatina inducida por ST 50 nM. Por tanto, la alteración funcional de la mitocondria está directamente relacionada con la cinética de liberación de cit c pero el hecho de que TG 10 M provoque antes que ST 50 nM la alteración mitocondrial no significa que las alteraciones estructurales de la célula se produzcan antes en presencia de TG. Esto sugiere la existencia de programas de muerte celular que son independientes de caspasas.
