Caracterización de la actividad bactericida de la proteína catiónica de eosinófilos (RNasa 3/ECP) y la RNasa derivada de epidermis (RNasa 7). Estudio por proteólisis limitada y mutagénesis dirigida

• Autores: Daniel Sánchez Centellas
• Directores de la Tesis: Ester Boix i Borràs (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Anton Pérez Pons (presid.), Esther Carreras (secret.), Isabel Bravo (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Ácidos nucleicos
    • Química macromolecular
      • Polipéptidos y proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Antibióticos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD  TESEO 
• Resumen

  • La superfamilia de las ribonucleasa A incluye proteínas de propiedades muy diversas, entre ellas RNasas altamente catiónicas con propiedades antipatógenas como: bactericida, antihelmíntica y antivírica. Las dos principales RNasas con capacidad bactericida son la RNasa 3, también conocida como Proteína Catiónica de Eosinófilos, (RNasa 3/ECP), y la RNasa 7, denominada también RNasa derivada de piel. La RNasa 3/ECP fue originalmente identificada como factor liberado por eosinófilos y sus niveles fisiológicos son marcadores ya establecidos en el asma y en varios tipos de inflamaciones y/o infecciones. En este proyecto se plantea establecer cuál es el mecanismo molecular de acción bactericida de la RNasa 3, que presenta abundancia de argininas en su superficie, así como estudiar la potencial participación de la actividad ribonucleasa en el proceso. La RNasa 7 es otra ribonucleasa implicada en el sistema inmunitario de defensa, de carácter igualmente catiónico, en este caso debido a la abundancia de lisinas en su superficie. El conocimiento de esta proteína procede de su purificación a partir de un extracto de epidermis. Su actividad ribonucleasa en las descamaciones epiteliales puede ser uno de los principales factores de degradaciones del RNA en las manipulaciones de laboratorio. Su mecanismo de acción aún está por estudiar en detalle. Esta proteína presenta una actividad RNasa superior en relación a la RNasa 3/ECP y al mismo tiempo una actividad bactericida ligeramente superior. La hipótesis de trabajo para el estudio de la RNasa 3/ECP es la identificación de las regiones determinantes de su actividad bactericida. Para ello se han realizado varias aproximaciones: a) la utilización de péptidos resultantes de escisión química y enzimática limitada b) la utilización de péptidos sintéticos y c) la utilización de mutantes en modelos de expresión a pequeña escala que expresan la proteína en su forma soluble. Por otra parte, el presente trabajo representa la puesta a punto del primer protocolo de expresión de RNasa 7 recombinante con elevado rendimiento. Se realizó un estudio comparativo entre las dos variantes de la RNasa 7 identificadas a partir de cDNA de queratinocitos (variante P75Y93) y de cDNA proveniente de riñón (variante A75H93). La hipótesis de trabajo para el estudio de la RNasa 7 es la caracterización de su actividad antibacteriana para las dos variantes identificadas comparándolas entre ambas y al mismo tiempo con la RNasa 3. Las propiedades diferenciales de estas proteínas nos facilitarán la comprensión de su función in vivo, durante el proceso de respuesta inmunitaria. Adicionalmente se pretende poner a punto, nuevos protocolos de cocristalización de la RNasa 3/ECP con potenciales ligandos naturales, para identificar los residuos de interacción con componentes de la pared bacteriana. Para la determinación de péptidos derivados de la 3/ECP RNasa vamos a elegir diferentes enfoques: los péptidos resultantes de la escisión enzimática o química, el análisis de péptidos sintéticos de la N-terminal. Los péptidos se separaron por filtración en gel o cromatografía en fase reversa.