Resumen de Topología del ADN nucleosomal en centrómeros y promotores génicos de Saccharomyces cerevisiae
Ofelia Díaz Ingelmo
Este proyecto de tesis se ha focalizado en determinar con precisión, en células de Saccharomyces cerevisiae, la diferencia de enlace del ADN estabilizada por nucleosomas canónicos in vivo, así como la contribución topológica del centrómero y de diferentes promotores génicos sensibles a topoisomerasa II. Para ello, tanto la secuencia TRP1ARS1 como derivados de esta, se han introducido en diferentes cepas de S. cerevisiae: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (?top1 TOP2 TOP3), se han extraído en forma de cromatina y se han analizado mediante técnicas electroforéticas para determinar su topología in vivo. Gracias al pequeño tamaño de estos anillos de ADN (nunca superior a 2kb), las distribuciones de topoisomeros generadas han permitido identificar cualquier modificación en la estructura de la cromatina. Topología región TRP1ARS1: La secuencia de 1453 pb de la región TRP1ARS1 (TA1) se ha ciclado y usado para la transformación de las diferentes cepas de S. cerevisiae. Un análisis topológico de los nucleosomas ensamblados en esta región ha determinado una diferencia de enlace (?Lk), respecto al anillo relajado, de -9.6 unidades. Este valor indica una estabilización de -1.37 unidades por nucleosoma, contrastando con el valor generalmente aceptado de -1 unidad por nucleosoma conocido como “linking number paradox”. Centrómero: El centrómero puntual de S. cerevisiae se caracteriza por: una secuencia de entre 111 y 120bp con tres elementos diferenciados (CDEI, CDEII y CDEIII) y por un hemisoma (H2A+H2B+cenH3+H4) con la histona H3 modificada (CenH3). Sobre las secuencias CDEI y CDEIII se unen dos complejos proteicos, Cbf1 y CBF3 respectivamente, capaces de doblar el ADN in vitro. Durante esta tesis se ha estudiado la topología del centrómero del cromosoma 4 de S. cerevisiae (CEN4), clonado en el anillo TA1, observando que produce una ganancia de +0.6 unidades de ?Lk. Este valor se ha establecido al comparar la topología del anillo TA1+CEN4 con la observada en anillos donde CEN4 ha sido mutado en CDEIII, impidiendo la unión de CBF3 y como consecuencia anulando su función, o sustituido por la secuencia High2 que estabiliza de forma muy eficiente un nucleosoma. El análisis topológico de anillos CEN4 de diferente tamaño y de anillos con la secuencia centromérica invertida, en cepas deficientes en topoisomerasa I y II, han ratificado que la estabilización de ?Lk =+0.6 es una propiedad robusta e intrínseca del complejo centromérico. Además, del estudio comparativo de los centrómeros CEN2, CEN4, CEN7 y CEN12 se ha descartado que la estabilización de +0.6 unidades dependa de la fase rotacional de CDEI y CDEIII y por tanto, se deba a una interacción entre ambos complejos proteicos. A partir de todos estos datos, se puede concluir que la estabilización de ?Lk = +0.6 estaría determinada por un enrollamiento dextrógiro del ADN en el hemisoma formado en CDEII o bien, por la combinación de distintos planos de curvatura del ADN en los segmentos CEI, CDEII y CDEIII. Promotores: Aprovechando la metodología usada para el análisis topológico del centrómero y del anillo TA1, se ha comenzado el estudio de la estructura de promotores de genes sensibles a topoisomerasa II. Se ha observado que la estructura de la cromatina de estos promotores no estabiliza el mismo número de enlace que segmentos de cromatina del mismo tamaño formados por nucleosomas típicos (cromatina control). Además,.la ianctivación de la topoisoemrasa II produce en estos promotores cambios topológicos distintos a los de la croamtina control lo que sugiere la posible presencia de mecanismos de regulación de la transcripción mediados por la topoisomerasa.
