Producción de la lipasa LIP2 de Candida rugosa en el sistema Pichia pastoris: caracterización y aplicación en reacciones de síntesis

• Autores: Manuel Rubén Alarcón Vivero
• Directores de la Tesis: Maria Dolors Benaiges Massa (dir. tes.), Francisco Valero Barranco (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2008
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Lafuente Sancho (presid.), Gregorio Alvaro Campos (secret.), María Luisa Rúa Rodríguez (voc.), Pilar Díaz Lucea (voc.), Gloria Caminal Saperas (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que C. rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. Con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZα bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en P. pastoris y la selección de clones productores de rLip2 activa. Comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, se determinó el pH óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. Al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por Western blot revelaron que estábamos en presencia se de agregados de rLip2, que no tenían actividad lipásica. La hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recupero la actividad enzimática, detectando el monómero de rLip2. La producción del producto heterólogo fue 10 veces superior a del microorganismo natural. Se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. Finalmente, se realizaron aplicaciones biocatáliticas de rLip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa.