Estructura, expresión y aspectos funcionales del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2)

• Autores: Bruno Ramos Molina
• Directores de la Tesis: Andrés Joaquín López Contreras (dir. tes.), Rafael Peñafiel García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Solano Muñoz (presid.), Antonio José Ruiz Alcaraz (secret.), Óscar Fernández Capetillo (voc.), Francisco Angel Perez Lara (voc.), Francisca Sánchez Jiménez (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
• Resumen

  • Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva esenciales para los procesos de crecimiento, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En mamíferos, los niveles intracelulares de poliaminas están altamente regulados a través de distintos mecanismos, como su biosíntesis, degradación y transporte a través de la membrana plasmática. La regulación post-traduccional de ornitina descarboxilasa (ODC), enzima clave de la ruta biosintética, está principalmente mediada por la acción de una familia de proteínas denominadas antizimas (AZs), cuya síntesis se estimula cuando los niveles de poliaminas son elevados. Las AZs se unen y inhiben ODC, e inducen su degradación proteasomal sin ubiquitinación. Además, las AZs inhiben la captación de poliaminas extracelulares, probablemente por interaccionar con el transportador de poliaminas. Además de las AZs, la actividad ODC está también indirectamente regulada por una familia de proteínas denominadas inhibidores de antizimas (AZINs). Estas proteínas, homólogas a ODC pero sin actividad enzimática, también interaccionan con las AZs, incluso de manera más eficiente que ODC, contrarrestando los efectos de las AZs sobre ODC. En mamíferos, la familia de los AZINs está compuesta por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Mientras que AZIN1 es una proteína de expresión ubicua que regula los niveles intracelulares de poliaminas y el crecimiento celular, AZIN2 se expresa mayoritariamente en testículo y cerebro, y su función fisiológica es menos conocida. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la expresión del gen Azin2 en tejidos de ratón, así como en profundizar en el conocimiento de diferentes aspectos funcionales y estructurales de AZIN2, proteína caracterizada por primera vez en nuestro laboratorio, comparando los mismos con los de sus proteínas homólogas ODC y AZIN1. Los objetivos del trabajo planteados, relacionados con la expresión, estructura, y función de AZIN2, fueron los siguientes: 1) Estudio de la expresión de AZIN2 y proteínas homólogas, así como la de las AZs en diferentes tejidos de ratón adulto mediante RT-PCR a tiempo real; 2) expresión de AZIN2 en testículo de rata y en testículos de ratones con alteraciones en la espermatogénesis; 3) influencia de AZIN2 y proteínas relacionadas con el metabolismo de poliaminas sobre el transporte de agmatina e influencia sobre el mismo de compuestos amino-guanidinios; 4) predicción de la estructura tridimensional de AZIN2 mediante modelado comparativo por homología, y estudio de la estructura cuaternaria de AZIN2 en células de mamífero; 5) análisis de la zona de unión a AZs (AZBE) en AZIN2 y sus parálogos, e influencia de los residuos conservados en las propiedades de las proteínas; 6) estudio de la vida media de AZIN2 y sus parálogos en células de mamífero, y de su posible mecanismo de degradación. En general, la metodología utilizada para la realización de este trabajo puede describirse como una combinación de técnicas de bioquímicas y de biología molecular, análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real y aproximaciones computacionales. Además, se utilizaron tanto líneas celulares, principalmente para los experimentos de transfección, como animales de laboratorio. En particular, se realizaron tratamientos específicos para la destrucción de células germinales haploides del testículo. Las conclusiones obtenidas del trabajo experimental son las siguientes: 1. El análisis mediante RT-PCR a tiempo real mostró que, además de cerebro y testículo, AZIN2 se expresa de manera significativa en otros tejidos de ratón adulto como epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón y pulmón, mientras que su expresión en diversas líneas celulares humanas de origen tumoral fue prácticamente indetectable. 2. Diversos modelos experimentales corroboran que en el testículo murino la gran mayoría del ARNm de AZIN2 se encuentra localizado en las células germinales haploides, descartando una expresión significativa en otros tipos celulares testiculares como las células intersticiales. 3. El patrón de expresión postnatal de AZIN2 y AZ3 en el testículo de rata es similar al encontrado en ratón, sugiriendo que estas proteínas también podrían estar participando en el proceso de espermiogénesis en esta especie. 4. La sobreexpresión de ODC o AZIN2 estimula la entrada de agmatina a las células COS7, mientras que las AZs la inhiben. En condiciones basales, dicho transporte, a concentraciones próximas a las fisiológicas, parece tener lugar a través del transportador general de poliaminas. 5. La estructura tridimensional de AZIN2, deducida mediante modelado comparativo, es similar a la descrita para sus parálogos ODC y AZIN1 en lo referente a los dominios barril / y hoja plegada , aunque difiere en regiones menos conservadas como ciertos bucles y las regiones N- y C-terminal. 6. A diferencia de ODC, AZIN2 es incapaz de formar homodímeros o a heterodimerizar con monómeros de ODC, aunque comparte con esta proteína la capacidad para interaccionar con las tres antizimas conocidas. 7. El análisis comparativo de la secuencia de la región AZBE en los diferentes ortólogos de AZIN2 y los de sus parálogos AZIN1 y ODC reveló la existencia de cinco residuos conservados (K116, A124, E139, L140 y K142 en la secuencia de AZIN2 de ratón). 8. Mientras que las mutaciones simples de cada uno de estos residuos en AZIN2 apenas afectaron la interacción de esta proteína con las AZs, las mutaciones dobles o triples de algunos de ellos anularon la capacidad de AZIN2 para interaccionar con las AZs, de manera independiente de la repercusión de dichas mutaciones sobre la carga eléctrica neta del elemento AZBE. 9. Los residuos conservados en la secuencia AZBE de ODC parecen ser muy importantes para la función de la enzima, ya que todas las mutaciones simples de los mismos, con la excepción de A123, disminuyeron notablemente la actividad catalítica de la enzima. 10. Los residuos E138 y L139 son críticos para la funcionalidad de ODC, ya que su sustitución por alaninas disminuye grandemente la homodimerización de la proteína, produciendo además la del segundo un gran aumento en su estabilidad por anular su interacción con AZ1. 11. En células transfectadas, AZIN2 es una proteína más lábil que ODC, mostrando una vida media de aproximadamente 90 minutos, y que a diferencia con ODC se estabiliza grandemente al interaccionar con las antizimas. 12. A diferencia con lo observado para ODC y AZIN1, la inhibición de la maquinaria proteasomal con lactacistina o MG132 produce una marcada disminución de la proteína AZIN2, sugiriendo que su degradación pudiera estar mediada por una vía alternativa a la del proteasoma 26S. Polyamines are small cationic molecules essential for cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. In mammals, the intracellular polyamine levels are tightly controlled by the regulation of different processes including their biosynthesis, degradation and transport across the plasma membrane. Post-translational regulation of ornithine decarboxylase (ODC), the key biosynthetic enzyme, is mainly mediated by the action of a family of small proteins named antizymes (AZs), whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind and inhibit ODC and target it to proteasomal degradation. Furthermore, AZs inhibit extracellular polyamine uptake presumably by interacting with the polyamine transport system. In addition to AZs, the ODC activity is also indirectly regulated by a family of proteins named antizyme inhibitors (AZINs). These proteins, closely related to ODC but without enzymatic activity, also interact with antizymes, even more efficiently than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. In mammals, the AZIN family is formed by two members: AZIN1 and AZIN2. Whereas AZIN1 is a ubiquitous protein that regulates intracellular polyamine levels and cell growth, AZIN2 is mainly expressed in testis and brain and its physiological role is mostly unknown. In this work we have focused on the study of the expression of the Azin2 gene in mouse tissues and the determination of different functional and structural aspects of AZIN2, protein first characterized in our laboratory, comparing the results with those of the homologous proteins ODC and AZIN1. The specific aims of this work were: 1) To determine the expression pattern of AZIN2 and homologous proteins, as well as those of AZs, in different adult mouse tissues by real-time RT-PCR; 2) to elucidate the AZIN2 expression in rat normal testes and in mouse testes with impaired spermatogenesis; 3) to analyse the effect of AZIN2 and proteins related to the polyamine metabolism and the influence of aminoguanidine compounds on agmatine transport; 4) to predict the tridimensional structure of AZIN2 by comparative modeling and to determine whether AZIN2 is able to form homodimers or heterodimers with ODC in mammalian cells; 5) to analyse the AZBE region of AZIN2 and its paralogs and the effect of conserved residues in the functionality of these proteins; 6) to study the half-life and the mechanism of degradation of AZIN2 and its paralogs in mammalian cells. In general the experimental methodology involved methods of molecular biology and biochemistry, gene expression analyses using real-time RT-PCR and computational approaches. In addition, we used several mammalian cell lines, mainly for transient transfection experiments, and laboratory animals. In particular, we performed specific treatments for the selective destruction of haploid germ cells in mouse testis. The conclusions obtained from our experiments were as follows: 1. Real-time RT-PCR analysis showed that, in addition to brain and testis, AZIN2 is expressed significantly in other adult mouse tissues such as epididymis, adrenal glands, pancreas, heart and lung, whereas its expression in several human cancer cell lines is almost undetectable. 2. In mouse testis, most AZIN2 mRNA is located in haploid germ cells, without significant expression in other testicular cells such as the interstitial cells. 3. The postnatal expression patterns of AZIN2 and AZ3 genes in rat testis are similar to those found in mice, indicating a evolutionary conserved expression pattern and suggesting that in the rat both proteins might be also participating in the spermiogenesis. 4. Agmatine uptake in COS7 cells is stimulated by AZIN2, ODC or SSAT overexpression, and inhibited by the presence of AZs. In basal conditions, agmatine uptake occurs through the polyamine transporter when the concentration of agmatine is close to the physiological values. 5. The tertiary structure of AZIN2, predicted by comparative modeling, is similar to those of its paralogs ODC and AZIN1 in the domains TIM / barrel and sheet, but it differs considerably in less conserved regions such as some loops and the N- and C-terminal regions. 6. Unlike ODC, AZIN2 is unable to form homodimers or heterodimers with ODC, but it is able to interact with the three AZ isoforms. 7. The comparative analysis of the AZBE sequences from multiple AZIN1, AZIN2 and ODC ortologs revealed the existence of five conserved residues (K116, A124, E139, L140 and K142 in mouse AZIN2). 8. In AZIN2, the double and triple substitutions of some of the conserved residues, but not single substitutions, drastically affected its interaction with AZs, independently from the effect of the substitutions on the net electric charge of the AZBE region. 9. In the case of ODC, the conserved residues play an important role in the function of the enzyme, since all single substitutions, with the exception of A123, significantly diminished ODC catalytic activity. 10. The residues E138 and L139 are critical for ODC functionality, since their substitution by alanines clearly reduced the formation of homodimers, causing the change L139A a potential increase of the protein stability by decreasing its interaction with AZ1. 11. In transfected cells, AZIN2 is more labile than ODC, having a half-life of approximately 90 minutes and being considerably stabilized by the interaction with AZs. 12. Unlike ODC and AZIN1, AZIN2 protein levels decreased after treatment with proteasome inhibitors, suggesting that its degradation might be mediated by an alternative route to proteasome 26S.