Resumen de Hifenaciones instrumentales entre la cromatografía líquida, diferentes sistemas detectores y nuevos métodos de pretratamiento de muestra para la determinación de vitaminas en alimentos
María Ángeles Bravo Bravo
El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral es desarrollar nuevos métodos analíticos para la determinación de vitaminas, constituyentes esenciales en la dieta humana. La Cromatografía Líquida (LC) combinada en línea con Espectrometría de Masas (MS) es una de las metodologías analíticas más sensibles y selectivas, y la aplicación de esta técnica está creciendo rápidamente en análisis de alimentos. Dependiendo de las estructuras químicas y características analíticas de los grupos de vitaminas analizados, los métodos analíticos utilizados son hifenaciones de LC con detector de diodos (LC-DAD), fluorescencia (LC-Fl) y LC-MS. La Metodología utilizada se basa en la aplicación de nuevos métodos de preparación de la muestra. Los métodos clásicos presentan inconvenientes, tales como ser tediosos y largos, y requerir volúmenes grandes de muestra y disolventes tóxicos. Teniendo como objetivo la química verde, surgen las técnicas modernas de preparación de muestra, que ofrecen la posibilidad de automatización, son limpias y selectivas, tienen mayor rapidez y eficacia, son baratas, sencillas y sin disolventes tóxicos. Así, se ha empleado la Extracción Líquida Presurizada (PLE), que es una tecnología verde emergente. Implica la extracción usando disolventes líquidos a temperatura y presión elevadas, que aumentan la solubilidad y las propiedades de transferencia de masa. También se ha utilizado la Microextracción en Fase Líquida (LPME), basada en la extracción de los analitos en una fase líquida usando cantidades muy pequeñas de disolventes orgánicos. La Microextracción Dispersiva Líquido-Líquido (DLLME) utiliza un sistema de disolventes ternario. El bajo consumo de tiempo y disolventes orgánicos son dos de las mayores ventajas de esta técnica. Finalmente, se ha empleado la Extracción en Fase Sólida (SPE), que implica una partición líquido-sólido, donde la fase extractante es un adsorbente sólido, como los nanotubos de carbono. Así pues, los Objetivos de esta Tesis Doctoral han sido estudiar los acoplamientos instrumentales de LC con detectores DAD, Fl y MS y procedimientos verdes de tratamiento de la muestra para la determinación de diferentes vitaminas hidrosolubles y liposolubles en diversos tipos de alimentos. El trabajo se ha dividido en dos partes, en función del grupo de vitaminas analizado y el tipo de detector empleado. Las conclusiones obtenidas son las siguientes: 1. Se han desarrollado métodos analíticos para la determinación de vitaminas hidrosolubles en alimentos de diferentes tipos, nutracéuticos e infantiles. Las vitaminas son cobalaminas, tiamina y sus ésteres y benfotiamina. Son compuestos polares y se analizan por LC en fase reversa con fase estacionaria RP-Amida C16 y un encapsulante de trimetilsililo. Las fases móviles son mezclas de acetonitrilo y fosfato diácido de potasio. Se utiliza DAD para cobalaminas o detección fluorescente para tiamina y sus ésteres y benfotiamina utilizando derivatización por oxidación a tiocromo. 2. Se utilizaron dos procedimientos miniaturizados para el tratamiento de la muestra. Para las cobalaminas se utiliza SPE con nanotubos de carbono multipared y un sistema de flujo para la adsorción de los analitos y su elución con dimetilsulfóxido. En el caso de la tiamina y benfotiamina se utiliza DLLME. 3. La extracción de las vitaminas se lleva a cabo mediante ultrasonidos para cobalaminas o digestión ácida y extracción enzimática para destruir las formas fosforiladas de las vitaminas B. 4. En la segunda parte de la Tesis, se desarrollan métodos para determinación de las cuatro vitaminas liposolubles (A, D, E y K) en alimentos funcionales como zumos de frutas, alimentos vegetales y lácteos, y alimentos infantiles. Se analizan por LC en fase reversa o fase normal y diferentes acoplamientos de LC con DAD o fluorescencia y MS con interfases ESI y APCI acoplados a DLLME. La extracción se realiza utilizando disolventes orgánicos, mediante PLE o saponificación alcalina. Palabras clave Cromatografía líquida Espectrometría de masas Detección por diodos Detección fluorescente Pretratamiento de la muestra Microextracción dispersiva líquido-líquido Vitaminas Alimentos The main objective of this Thesis, is the development of new analytical methods for the determination of vitamins, essential constituents in the human diet. Liquid chromatography (LC) combined on-line with mass spectrometry (MS) is one of the more sensitive and selective analytical methodologies, and this technique is widely applied in food analysis. Depending on the chemical structures and analytical characteristics of the groups of vitamins analyzed, the analytical methods used are hyphenations of LC with diode array detector (LC-DAD), fluorescence (LC-Fl) and LC-MS. The methodology applied is based on the application of new methods for sample preparation. Classical methods have inconveniences, as being tedious and large, requiring great volumes of sample and toxic organic solvents. With the objective of green chemistry, modern sample preparation techniques appeared, which offer the possibility of automatization, are clean and selective, have higher speed and efficiency, are cheap, simple and without toxic solvents. Thus, Pressurized liquid extraction (PLE) has been used, being an emergent green technology, based on the extraction using liquid solvents at high temperature and pressure, which increase the solubility and the properties of mass transfer. Liquid-phase microextraction (LPME) was also used and is based on the extraction of the analytes in a liquid phase using very small amounts of organic solvents. Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) uses a ternary solvent system. The low time and organic solvents consume are the two main advantages of this technique. Finally, Solid phase extraction (SPE) implies a liquid-solid partition, where the extractant phase is a solid sorbent, as multiwalled carbon nanotubes. Thus, the objectives of this Thesis were to study the instrumental coupling of LC with DAD, Fl and MS detection and green sample treatment procedures for the determination of several hydrosoluble and liposoluble vitamins in different type of foods. The study is divided in two parts, depending on the group of vitamins analyzed and the type of detector used. The following conclusions have been obtained: 1. Analytical methods are developed for the determination of hydrosoluble vitamins in different type of foods, nutraceuticals and baby foods. The vitamins are cobalamins, thiamine and its esters and benfothiamine. They are polar compounds and are analyzed by LC in reversed phase with a stationary phase RP-Amide C16 and an endcapping of trimethylsilyl. The mobile phases are mixtures of acetonitrile and potassium phosphate (pH 7). DAD detection is used for cobalamins or fluorescence for thiamine and its esters and benfothiamine using derivatization by oxidation to thiochrome. 2. Two miniaturized procedures have been developed for the sample treatment. For cobalamins, SPE was used with multiwalled carbon nanotubes and a flow system for the adsorption of the analytes and its elution with dimethylsulphoxide. DLLME was used for thiamine and benfothiamine. 3. The extraction of the vitamins was carried out using ultrasounds for cobalamins or acid digestion and enzymatic extraction for destroying the phosphorilated forms of the vitamins B. 4. In the second part of the Thesis, new methods are developed for the determination of the four liposoluble vitamins (A, D, E and K) in functional foods as fruit juices, vegetables, milk foods and baby foods. They are analyzed by LC in reversed phase or normal phase and different couplings of LC with DAD or fluorescence and MS with interfaces of electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI) coupled to DLLME. The extraction was carried out using organic solvents, by PLE or alkaline saponification. Key words: Liquid chromatography Mass spectrometry Diode array detection Fluorescence detection Sample pretreatment Dispersive liquid-liquid microextraction Vitamins Foods
