Resumen de Evolution and molecular characterization of tick-borne Anaplasmataceae and implications for pathogen diagnostics and control.
Esta tesis se concentra en la caracterización molecular de patógenos transmitidos por garrapatas, los cuales han cobrado una gran importancia en los últimos años debido a su impacto en la economía agropecuaria, y en la salub pública de países tanto desarrollados como en vía de desarrollo (Perez y col., 2006; Rikihisa, 2010; Aubry y Geale, 2011). Particularmente la tesis usa una combinación de herramientas moleculares, bioinformaticas y filogenéticas para estudiar la variación genética de dos importantes patógenos llamados Anaplasma marginale y Ehrlichia canis, los cuales afectan principalmente al ganado bovino y los perros domésticos respectivamente (Aubry y Geale, 2011; Zweygarth y col., 2014). Antes de introducirnos en las particularidades de estos dos patógenos, es importante resaltar la relevancia del estudio de la variación genética de los patógenos en general y de A. marginale y E. canis en particular. Esto se podría resumir brevemente diciendo que la variabilidad genética, entendida como cambios en la secuencia de ADN, constituye la base de los mecanismos de evolución (cambio en el tiempo) de los patógenos y por tanto determinará la emergencia de nuevos patógenos o nuevas cepas de patógenos existentes pero con diferentes patrones de patogenicidad, virulencia y transmisión (Palmer y Brayton, 2013). Al mismo tiempo la variabilidad genética es uno de los mecanismos por el cual los patógenos escapan la vigilancia del sistema immune, permitiendo el establecimiento de infecciones persistentes de las cuales A. marginale y E. canis son un buen ejemplo (Zhang y col., 2008; Palmer y Brayton, 2013). A. marginale y E. canis son ¿-proteobacterias de la familia Anaplasmataceae y de los géneros Anaplasma y Ehrlichia respectivamente que están ampliamente distribuidas en el mundo (Zhang y col., 2008; Aubry y Geale, 2011). Ellos son patógenos intracelulares obligatorios que se localizan en vacuolas que forman en las células infectadas de los hospederos (Blouin y Kocan, 1998; Popov y col., 1998). Estos microorganismos tienen complejos ciclos de vida los cuales están caracterizados por una transmisión continua en la cual se alternan un hospedero vertebrado (e.g. vacas y perros) y uno invertebrado (garrapatas de animales domésticos) al que se le llama vector pues pasa los patógenos de un individuo infectado a otro que puede ser sano o no (Kocan y col., 2004 ; Bremer y col., 2005). Las garrapatas del perro (Rhipicephalus sanguineus) y de la vaca (Rhipicephalus microplus) constituyen sus principales vectores invertebrados (Kocan y col., 2004 ; Bremer y col., 2005). A. marginale y E. canis son modelos de patógenos altamente variables en los cuales se ha demostrado que la variabilidad genética influye en su epidemiología (Palmer y Brayton, 2013; Aguiar y col., 2013). Para el estudio de la variabilidad genética de A. marginale y E. canis se han usado fundamentalmente proteínas de membrana que son reconocidas por el sistema immune del hospedero vertebrado, despertando una respuesta immune, pero que también interaccionan con las células blanco para facilitar la unión e invasión bacteriana (de la Fuente y col., 2010). Las glicoproteínas MSP1a (Major surface protein 1 alfa ¿ en sus siglas en inglés) y TRP36 (Tanden Repeat Protein 36 ¿ en sus siglas en inglés) han mostrado ser útiles para la caracterización genética de diferentes cepas variables de A. marginale y E. canis respectivamente (Cabezas-Cruz y col., 2013a; Zweygarth y col., 2014). A pesar de que existen evidencias de que MSP1a y TRP36 (también conocida como gp36) son altamente variables, se sabe poco acerca de la evolución de esta variación y si tiene alguna relación con la transmisión por vectores. Al estudiar este tema, algunas preguntas interesantes se ponen de relieve. ¿Que factores provocan o influyen en que la variabilidad genética de A. marginale y E. canis sea mayor en algunas zonas del mundo comparadas con otras?, ¿Tienen los vectores o las diferentes especies de vectores alguna influencia sobre esto? y ¿Conocer estos factores nos ayudará a implementar medidas de control y diagnóstico para estos agentes? Nuestra hipótesis de trabajo en el desarrollo de esta tesis fue que la variabilidad genética de las proteínas de membrana (como MSP1a y TRP36) reflejan la evolución de las interacciones entre patógeno y hospederos (vertebrado e invertebrado) de A. marginale y E. canis y además que este conocimiento se puede usar tanto para estudios epidemiológicos como para implementar medidas de control y medios diagnóstico. Contenido de la investigación El gen msp1¿ es una herramienta genética relevante para la caracterización de A. marginale mundialmente. Al estudiar varias cepas de A. marginale fue evidente que el peso molecular de MSP1a variaba entre aislados (de la Fuente y col., 2001). Posteriormente se determinó a nivel molecular que esta variación se debia a que MSP1a presenta hacia el N-terminal, repeticiones en tandem cuyo número varia entre diferentes aislados. Al mismo tiempo las diferentes posiciones de amino ácidos dentro de estos tandem también varian. Es importante señalar que el gen msp1¿ es un marcador genético estable dentro de la misma cepa, lo cual quiere decir que su secuencia no varia en la misma cepa cuando esta infecta tanto al hospedero vertebrado como invertebrado, lo cual hace posible su uso para seguir el comportamiento epidemiológico de cepas específicas de A. marginale (Palmer y col., 2001 ; de la Fuente y col., 2001). Para tener una idea de la variabilidad de MSP1a a nivel mundial, hicimos un análisis de todas las secuencias depositadas en GenBank. Identificamos 224 diferentes secuencias de MSP1a (los cuales deben provenir de diferentes cepas) con 193 diferentes tipos de repeticiones en tandem, lo cual representa una gran diversidad (Cabezas-Cruz y col., 2013a). En el curso de nuestra investigación condujimos estudios epidemiológicos en Brazil y Sudáfrica en vacas y bufalos de agua, usando el gen msp1¿. Nuestros resultados demostraron por primera vez a nivel molecular la presencia de A. marginale en la mayoría del territorio nacional de Sudáfrica (Mutshembele y col., 2014). Esto tiene una gran relevancia puesto que hasta entonces, solo se tenía conocimiento de la presencia de A. marginale en este país principalmente a partir de datos serológicos y de microscopía de luz que se basan en técnicas que no son muy precisas y arrojan gran cantidad de resultados falsos positivos (serología) o falsos negativos (microscopía de luz). Al mismo tiempo evidenciamos que A. marginale tiene una alta variabilidad genética en Sudáfrica (Mutshembele y col., 2014). Lo cual es consistente con los estudios que efectuamos en Brasil donde A. marginale es también endémica (Pohl y col., 2013). Al analizar la evolución de dicha diversidad genética en Sudáfrica, algo extremadamente interesante apareció. Todas las nuevas variantes de repeticiones en tandem que se encuentran exclusivamente en Sudáfrica, evolucionaron a partir de variantes que estan diseminadas por todo el mundo (Mutshembele y col., 2014). Esto tiene importantes consecuencias para el control de A. marginale ya que MSP1a es un buen candidato vacunal (Palmer y col., 1986), cuyo uso ha sido descontinuado fundamentalmente por la falta de cross-proteccion, es decir la capacidad de una variante MSP1a de proteger contra cepas de A. marginale que presenten diferentes variantes de esta proteína. Nuestro estudio revela que las vacunas basadas en MSP1a deben tener en cuenta la variabilidad genética local de A. marginale pero también que existen variantes de repeticiones en tandem que estan altamente representadas en todas partes del mundo, las cuales pudieran servir como base para una vacuna universal efectiva contra todas las cepas. La variabilidad genética de msp1¿ evoluciona acoplada a diferentes garrapatas vectores de A. marginale. Se ha reportado que alrededor de 20 especies de garrapatas pueden servir como vectores de A. marginale (Kocan y col., 2004). En regiones de Argentina donde la garrapata del ganado bovino Rhipicephalus microlus es el principal vector de A. marginale, se ha reportado mayor variabilidad genética en esta bacteria que en regiones donde esta garrapata ha sido erradicada (Ruybal y col., 2009). En otro estudio se encontró la menor proporción de amino acidos conservados en MSP1a en aquellas ecoregiones donde el clima es mas apropiado para R. microlus (Estrada-Peña y col., 2009). Estos estudios sugieren dos cosas: (i) que la transmisión por garrapatas en general aumenta la variabilidad genética de A. marginale o (ii) que la transmisión por R. microplus en particular afecta la variabilidad genética de A. marginale. Para testar estas hipótesis, dividimos el mundo en categorias abióticas que se sabe son favorables para diferentes especies de garrapatas vectores (R. microplus, R. annulatus, R. decoloratus y Dermacentor spp.), luego correferenciamos diferentes cepas de A. marginale con cada una de estas ecoregiones y estudiamos como se comparta la variabilidad genética de A. marginale en relación con diferentes ecoregiones que favorecen el desarrollo de diferentes species de vectores. Encontramos algo extremadamente interesante, en las regiones donde R. microplus (e.g. Venezuela) es el principal vector, la variabilidad genética es mayor comparada con regiones donde los principales vectores son Dermacentor spp (e.g. USA). Esto tiene mayores implicaciones para el control de A. marginale usando MSP1a como candidato vacunal. En las regiones donde R. microplus es el principal vector, el control de A. marginale debe estar combinando con el control de este vector. El gen trp36 es una herramienta genética relevante para la caracterización de E. canis y de nuevas especies patógenas evolucionadas de E. canis. Aplicando el concepto explicado anteriormente para msp1a en A. marginale, usamos entonces el gen que codifica para una proteína de membrana de E. canis (TRP36) para estudiar la variabilidad genética de esta bacteria (Zweygarth y col., 2014). Como MSP1a, TRP36 es una glicoproteína de membrana que presenta repeticiones en tandem. Pero a diferencia de MSP1a, los tandem de TRP36 en E. canis son todos iguales en el mismo aislado y hasta hoy se han reportado solo tres tipos de tandem, TEDSVSAPA, presente en cepas de E. canis de USA, China, Africa, España, Brasil e Israel; EASVVPEA, presente en cepas de Brasil y TEDPVSATA, presente en la cepa Israel-Ranana (Aguiar y col., 2013). La mayor variabilidad genética de TRP36 (identidad de 87% ¿ 100%) no se encuentra entonces en la region de los tandem sino en la region N-terminal que esta previa a estos (Zweygarth y col., 2014). Usando análisis filogenéticos basados en TRP36, nosotros identificamos un cluster (B) formado por cepas de China y Sudáfrica y otro cluster (A) formado por el resto de las cepas de otras regiones (Zweygarth y col., 2014). El cluster B se diferencia del A en dos propiedades moleculares: (i) deleción de la glicina (G) 117, y (ii) un sequon adicional de N-glicosilación. Los dos cambios pudieran tener implicaciones estructurales, funcionales y antigénicas para TRP36. Primeramente, G es un amino ácido pequeño que confiere una gran flexibilidad conformacional al plegado proteico debido a la ausencia de cadenas laterales en sus carbonos centrales (Betts and Russell., 2003). En segundo lugar, TRP36 ha sido descrita como una glicoproteína que contiene O-glicanos en sus tandem repetidos (Doyle y col., 2006). Se encontró además que la O-glicosilación juega un papel importante en la antigenicidad de TRP36, ya que al remover los grupos O-glicanos de los tandem repetidos, esta se reduce drásticamente (Doyle y col., 2006). Sin embargo, no se ha demostrado experimentalmente que esta proteína tenga N-glicanos unidos a su N-terminal, lo cual no niega que los pueda tener. En caso de existir, un patron diferente de glicosilación impacta diferentes propiedades de las proteínas como su solubilidad, estabilidad, secreción, resistencia a las proteasas, interacciones proteína-proteína e immunogenicidad (Spiro, 2002). Sin duda una de las aplicaciones mas interesantes de TRP36, ha sido su uso como marcador complementario para la characterización molecular de nuevas especies de Erlichia cercanas a E. canis. En la tesis describimos una nueva especie, llamada E. mineirensis, que fue aislada de hemolinfa de hembras R. microplus de Brasil (Cabezas-Cruz y col., 2012). Esta especie ha sido propagada continuamente in vitro en las células IDE8 provenientes de embriones de la garrapata Ixodes scapularis (Zweygarth y col., 2013), pero también se ha demostrado que crece en las células caninas DH82 y en las células de aorta bovina BA886. Cinco genes fueron utilizados para la caracterización molecular de E. mineirensis: gltA, groEL, dsb, 16SrRNA y trp36 (Cabezas-Cruz y col., 2012). Se determinó a nivel molecular que E. mineirensis es una nueva especie dentro del genéro Ehrlichia, filogenéticamente relacionada con E. canis y que presenta una ultraestructura muy parecida a esta última (Cabezas-Cruz y col., 2012, 2013b; Zweygarth y col., 2013). Posteriormente, Aguiar y colaboradores (2014) aislaron un organismo, Ehrlichia sp. UFMT-BV, muy similar a E. mineirensis y demostraron que era patogénico para vacas. Los dos organismos, E. mineirensis y Ehrlichia sp. UFMT-BV tienen ortologos de TRP36 con una secuencia nueva de repeticiones en tandem: VPAASGDAQ y AQVSADSGA, respectivamente (Cabezas-Cruz y col., 2012; Aguiar y col., 2014). El hecho de que E. mineirensis y Ehrlichia sp. UFMT-BV han sido associados a R. microplus y vacas es algo bastante interesante pues el principal vector de E. canis es la garrapata R. sanguineus (Bremer y col., 2005) y su hospedero fundamental son los perros (Zweygarth y col., 2014). Esto sugiere que estas nuevas especies de Ehrlichia experimentaron un cambio de hospedero vertebrado y invertebrado. El cómo los patógenos pueden colonizar nuevos hospederos es una pregunta retadora en biología evolucionaria (Dennehy y col., 2010). El cambio de hospedero de cepas variables de E. canis que luego se diferenciaron de las cepas parentales, es una hipótesis plausible para el origen de E. mineirensis y Ehrlichia sp. UFMT-BV. Nuestra hipótesis de trabajo es que este cambio de hospedero ocurrió en un escenario donde perros infectados con cepas variables de E. canis, como han sido encontradas en Brasil previamente (Aguiar y col., 2013), fueron la fuente de infección de R. microplus o R. sanguineus que posteriormente infestaron vacas. Ambas especies de garrapatas son capaces de infestar perros (Dantas-Torres, 2009; Szabó y col, 2010) y vacas (Mirzaei y Khedri, 2014). El escenario implicando a R. microplus es poco probable ya que esta garrapata es de un solo hospedero, sin embargo, se ha demostrado que durante su ciclo parasítico, R. microplus se puede mover entre hospederos (Chevillon y col., 2007), incrementando la posibilidad de transmissión horizontal de patógenos a diferentes hospederos. Cambios en las presiones evolutivas relacionadas con esta nueva asociación de hospederos puede haber resultado en especies completamente diferentes. Conclusiones 1- El uso de proteínas de membrana, como MSP1a y TRP36, con una alta variabilidad genética son adecuadas para la evaluación de la diversidad genética de bacterias de la familia Anaplasmataceae. 2- La evolución de MSP1a esta acoplada a diferentes especies de vectores de A. marginale. 3- La variabilidad genética de TRP36 refleja la historia evolutiva de especies evolucionadas de E. canis. 4- Las proteínas de superficie, tales como MSP1a, presentes en especies de la familia Anaplasmataceae y que están envueltas en las interacciones entre garrapatas y patógenos, pueden ser usadas para el desarrollo de medidas de control para reducir la infección y transmisión de patógenos y asi el riesgo de adquirir enfermedades transmitidas por garrapatas.
