Development of artificial viruses for nanomedicine and gene therapy

• Autores: Paolo Saccardo
• Directores de la Tesis: Antonio Villaverde Corrales (dir. tes.), Neus Ferrer Miralles (dir. tes.), Escarlata Rodríguez Carmona (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Carlos Saíz Calahorra (presid.), Nerea Roher Armentia (secret.), Ursula Rinas (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD  TESEO 
• Resumen

  • La convergencia de diversas disciplinas como la biotecnología, biología molecular e ingeniería genética en el desarrollo de vehículos terapéuticos a escala nanometrica para la entrega de moléculas terapeuticas, se plantea como una herramienta con un elevado potencial en el campo de la nanomedicina. El mayor reto de estos nanovehiculos es permitir una eficaz entrega de ácidos nucleicos, proteínas o incluso fármacos, con una elevada especificidad celular para poder así disminuir la dosis administrada y por eso reducir sus toxicidad. En el caso de los ácidos nucleicos, la especificidad de entrega y la protección de los mismos de las nucleasas son los puntos clave para prever el desarrollo de estos sistemas. Sin embargo, el uso de vectores virales que parecían contener todos los elementos necesarios para aplicar la terapia génica extensivamente, ha topado con serios problemas de toxicidad e inmunogenicidad que limitan su uso. Así pues, el desarrollo de vectores de entrega no víricos, degradables y de diverso origen como dendrímeros, liposomas, polímeros, proteínas modulares o virus-like particles (VLPs), entre otros, se ha revelado como un campo de investigación que promete aportar las herramientas necesarias para desarrollar vehículos auto ensamblables “inteligentes” capaces de superar las barreras impuestas por el sistema biológico y llegar al tejido o compartimiento celular diana sin provocar las reacciones adversas que limitan el utilizo de sistemas virales. En el óptica de estudiar la optimización de nanovehiculos autoensamblabels de origen proteicos para la terapia génica, hemos explorado por un lado la caracterización de VLPs obtenidas mediante la expresión del la proteína VP1 de la capside viral del human JC virus tanto en E.coli, como en células de insecto. Por otro lado hemos estudiado la optimización del proceso de producción y autoensamblado de proteínas multifuncionales y evaluado su capacidad de unir y proteger los acidos nucleicos de la degradación por parte de proteasas. Así pues, diferentes entornos genéticos del sistema de control de calidad en E. coli han evidenciado la alteración del rendimiento de producción y de calidad conformacional en el ensamblado de las VLPs del virus JC. En este tesis hemos explorado los efectos de la chaperona DnaK en la producción y calidad conformacional de las VLPs formadas por la proteína VP1 a través de tres cepas caracterizadas por la presencia/ausencia/sobre expresión de la chaperona DnaK. Se ha observado que la ausencia de esta chaperona promueve una mayor rendimiento de producción pero al mismo tiempo ha demostrado efectos negativos en el ensamblaje de las VLPs. El mismo concepto se ha aplicado en estudios en células de insecto, co-produciendo la proteína VP1 y las chaperonas bacterianas DnaK/DnaJ. En este caso el rendimiento de producción se ha visto afectado por la presencia de las chaperonas contrariamente a la calidad conformacional que se ha visto beneficiada. Paralelamente, estudios sobre las propiedad arquitectónicas de la proteína modular R9-GFP-H6 y sus interacciones con el ADN ha permitido establecer las condiciones optímales para la interacción de sus dominios peliotropicos, resultante en el auto ensamblado de esta proteína en complejos ADN/nanoparticulas capaces de proteger el ADN de la acción de proteasas. Además se ha propuesto un modelo bioinformática de las nanoestructuras estudiadas. Consecuentemente a la caracterización de la R9-GFP-H6, diferentes modelos de proteína modula auto-ensamblables derivada de esta han sido estudiados para evaluar sus eficacias a la hora de unir y transportar ADN al núcleo celular. En esta tesis se ha propuesto una modificación del protocolo de purificación que permite aumentar sensiblemente la eficacia de las diferentes nanoparticulas implicadas. Por lo tanto, en todos estos trabajos, queda reflejado que el desarrollo de virus artificiales para nanomedicina y terapia génica es un proceso fascinante y multidisciplinario donde las nanoparticulas de origen proteicos, sean proteínas modulares o virus like particles, están siendo concebidas como una herramienta extremadamente potente para la obtención de productos eficientes, seguros y comercialmente atractivos. Con esta tesis, entonces, se pretende entrar a fondo en las técnicas de desarrollo y mejora del proceso productivo de novedosas nanoestructuras proteicas para sus utilizo en nanomedicina.