Estudio de la proteína cortactina en la adhesión celular y de la familia de proteínas adaptadoras CrK en la formación del pedestal de actina por "Escherichia coli" enteropatógena

• Autores: María Eugenia Meiler Rodríguez
• Directores de la Tesis: Narcisa Martínez Quiles (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Concepcion Gil Garcia (presid.), María Esther Lafuente Duarte (secret.), Isabel Correas Hornero (voc.), Michael Hensel (voc.), Luis Ángel Fernández Herrero (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense (pdf)
• Resumen

  • Cortactina es una proteína de unión a filamentos de actina que fue inicialmente identificada como sustrato de la proteína tirosina quinasa Src. Además, se ha descrito que cortactina está regulada por un mecanismo de acetilación y deacetilación en residuos de lisina. Sin embargo, el efecto de la fosforilación de cortactina en residuos de tirosina in vivo y su relación con la acetilación no había sido dilucidado. Por otra parte, la proteína adaptadora CrkII fue localizada mediante inmunofluorescencia en unas estructuras ricas en actina denominadas pedestales formados por Escherichia coli enteropatógena, EPEC. Posteriormente, nuestro grupo descubrió que la familia de proteínas adaptadoras Crk presentan un papel inhibitorio y redundante en la formación del pedestal de actina por EPEC. La principal ruta de polimerización de actina en los pedestales implica la interacción de la proteína bacteriana Tir fosforilada en residuos de tirosina con la proteína Nck que a su vez interacciona con NWASP, la cual activa al complejo Arp23. Objetivos Parte I Estudio de la fosforilación de cortactina en residuos de tirosina y su efecto en el spreading celular Para llevar a cabo este objetivo se ha empleado un sistema denominado Functional Interaction Trap, FIT, que promueve la fosforilación de cortactina en residuos de tirosina por la tirosina quinasa Src in vivo. El sistema FIT consiste en la expresión en las células de cortactina y de la tirosina quinasa Src, ambas fusionadas a unas hélices sintéticas complementarias. En este estudio empleamos el sistema FIT para dilucidar la relación entre la fosforilación en residuos de tirosina y la acetilación de cortactina. Además, utilizamos el sistema FIT para analizar el papel de la fosforilación de cortactina en residuos de tirosina en el spreading celular, así como su interacción con la tirosina quinasa FAK durante dicho proceso. Nuestros resultados han demostrado que el sistema FIT promueve la fosforilación de cortactina en residuos de tirosina por Src de forma eficiente y específica. Además, cortactina fosforilada en residuos de tirosina no se encuentra acetilada simultáneamente. Asimismo, cortactina promueve el spreading celular mientras que cortactina fosforilada en residuos de tirosina lo inhibe, impidiendo su interacción con la quinasa FAK. Finalmente encontramos que la interacción de cortactina y la quinasa FAK no está medida por NWASP. Parte II Estudio del papel inhibitorio y redundante de la familia de proteínas adaptadoras Crk en la formación de pedestales por EPEC El objetivo fue determinar el mecanismo por el cual la familia de proteínas adaptadoras Crk desempeñan una función inhibitoria y redundante en la formación de pedestales de actina inducidos por EPEC. Para ello se estudió la localización de diferentes mutantes de Crk durante la infección por EPEC. Además se analizó el estatus de fosforilación y la localización de las isoformas de Crk fosforiladas durante la infección por EPEC. Finalmente se analizó la interacción del dominio SH2 aislado de las proteínas CrkII y CrkL con la proteína efectora Tir. En conclusión, el dominio SH2 aislado de CrkII es suficiente para su localización en los pedestales. Además, este dominio es capaz de inhibir la formación de los pedestales, probablemente debido a que impide la localización de la proteína Nck en estas estructuras. Esto podría deberse a que CrkII y CrkL son capaces de interaccionar a través de su dominio SH2 con la proteína bacteriana Tir, para lo cual se requiere la fosforilación del residuo de tirosina 474 de Tir. Por otra parte, la infección por EPEC promueve la fosforilación del residuo de tirosina regulatorio de CrkII y CrkL en los pedestales, lo cual podría bloquear el efecto inhibitorio de estas proteínas adaptadoras en la formación de pedestales de actina por EPEC