Estudio del gen CLCN1 en pacientes de miotonía congénita: caracterización funcional de nuevas mutaciones

• Autores: Carmen Palma Milla
• Directores de la Tesis: Jesús Molano Mateos (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Miguel García Sagredo (presid.), Francisco Portillo Pérez (secret.), Carmen Prior de Castro (voc.), Pilar Carrasco Salas (voc.), Samuel Ignacio Pascual Pascual (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular, Biomedicina y Biotecnología (Biociencias Moleculares)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • RESUMEN La miotonía congénita (MC) es la forma más común de miotonía no distrófica y está causada por mutaciones en el gen CLCN1, codificante del principal canal de iones cloruro del músculo esquelético (ClC-1); la alteración de la función de este canal, regulado por voltaje, da lugar al fenómeno de miotonía. La enfermedad se puede heredar con un modo de herencia dominante (enfermedad de Thomsen) o recesiva (enfermedad de Becker). El fenotipo clínico de ambas formas de la enfermedad es similar aunque la forma recesiva se caracteriza por una mayor gravedad de los síntomas.

    El diagnóstico clínico de MC debe sospecharse cuando se observan episodios de rigidez muscular (miotonía), fenómeno warm-up, miotonía clínica, patrón electromiográfico característico y/o historia familiar. El diagnóstico molecular de miotonía congénita consiste en el análisis del gen CLCN1.

    En esta Memoria se han estudiado a nivel genético la serie de pacientes afectos de MC más extensa descrita en población española; compuesta de 71 casos índice y familiares, alcanzando un total de 99 individuos. El diagnóstico genético de estos pacientes se llevó a cabo mediante el estudio de variantes en el gen CLCN1 con técnicas de secuenciación y Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA); también se realizó el análisis del gen SCN4A (secuenciación de exones seleccionados) causante de paramiotonía congénita. Con este algoritmo diagnóstico se alcanzó una tasa diagnóstica del 51%; de ellos el 88% portaban variantes patogénicas en CLCN1 y un 12% resultaron portadores de variantes patogénicas en SCN4A. No se detectaron mutaciones del tipo de grandes deleciones/duplicaciones en ninguno de los pacientes estudiados. En esta Memoria se describen 27 variantes patogénicas diferentes en CLCN1, 19 mutaciones habían sido descritas previamente en la literatura científica y 8 mutaciones son caracterizadas por primera vez en este trabajo; éstas últimas son analizadas con predictores in silico y analizada su conservación a lo largo de la evolución. Además se ha realizado por primera vez el ensayo funcional electrofisiológico de 6 de estas mutaciones de cambio de sentido. Para ello se realizó mutagénesis dirigida para la obtención de los ADNc mutantes de CLCN1 y se ensayó en condiciones de "clamp de voltaje" con célula entera. Se sometieron las células HEK293 a un protocolo de pulsos a distintos voltajes para obtener curvas de probabilidad de apertura (P0) y se estudió la densidad de corriente de las células transfectadas con CLCN1 mutante y mutante/silvestre (relación 1:1).

    Por último se abordó el estudio del probable efecto fundador de la mutación c.180+3A>T. Para ello se analizaron 6 polimorfismos en el gen CLCN1 en pacientes portadores de la mutación y en población control. Se llevó a cabo un estudio de haplotipos y un estudio de asociación caso-control. No se encuentraron diferencias significativas entre ambos grupos en cuanto a la frecuencia o tipos de haplotipo encontrados, por lo que no se pudo confirmar la existencia de un efecto fundador.