Recombinant expression and characterization of ram seminal plasma proteins rsvp14 and rsvp20. Revisiting the binder of sperm protein family
- Autores: Edith Serrano Blesa
- Directores de la Tesis: José Álvaro Cebrián Pérez (dir. tes.), María Teresa Muiño Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel López Pérez (presid.), Álvaro Sánchez Ferrer (secret.), Patricia Grasa (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El uso de la inseminación artificial (IA) en cualquier especie animal requiere el mantenimiento del semen en condiciones no fisiológicas. En la especie ovina, la IA con dosis refrigeradas es más común que con dosis congeladas debido a los malos resultados de fertilidad obtenidos con semen congelado, lo que está limitando en gran medida, entre otras cosas, el desarrollo del sector. Esto se debe fundamentalmente a la mayor sensibilidad al frío de los espermatozoides ovinos en comparación con los de otras especies. El proceso de criopreservación induce una serie de daños celulares que pueden estar directamente derivados del daño por frío (cold-shock) o ser causados por la dilución inicial de la muestra, la cristalización del hialoplasma y el estrés osmótico. Referible a los daños inducidos por frío se ha descrito una capacitación prematura o criocapacitación debida a la redistribución lípido-proteica de la membrana que sería la razón de la baja fertilidad obtenida con esas dosis.
Trabajos previos de nuestro grupo demostraron que las proteínas del plasma seminal (PPS) son capaces de proteger y reparar, al menos parcialmente, algunos de los daños producidos por el frío en la membrana del espermatozoide ovino (Barrios et al. 2000; Pérez-Pé et al. 2001; Barrios et al. 2005), así como mantener a los espermatozoides en un estado descapacitado (Mendoza et al. 2013; Luna et al. 2015). Este efecto parece deberse a dos fracciones proteicas del plasma seminal (Barrios et al. 2005; Fernández-Juan et al. 2006) compuestas principalmente por dos proteínas llamadas RSVP14 y RSVP20. El conocimiento profundo de las proteínas presentes en estas fracciones es esencial para entender sus mecanismos de acción. Por ello, el objetivo general de esta Tesis fue caracterizar las proteínas del plasma seminal ovino con capacidad protectora y reparadora de los espermatozoides respecto al daño por frío. Esto se llevó a cabo tanto de manera individual como con un análisis filogenético y de contexto genético de la familia proteica a la que pertenecen (Artículos 1 y 2). El estudio de las secuencias codificantes permitió identificar una tercera proteína muy similar a RSVP20 llamada RSVP22. Así mismo, se ha podido confirmar que las tres proteínas pertenecen a la familia BSP (Binder of SPerm) cuya principal característica es la presencia en tándem de dos dominios de fibronectina tipo 2 (Fn-2). Las diferencias en la estructura de los dominios Fn-2 muestran la existencia de tres subfamilias BSP, BSPH1 y BSPH2 que evolucionaron paralelamente para cubrir diferentes funciones biológicas. Las tres proteínas se encuentran en la subfamilia BSP dentro de la cual RSVP14 forma parte del grupo BSP1 mientras que RSVP20 y 22 pertenecen al grupo BSP5. Además, los dominios Fn-2 presentan unas características particulares que posibilitan la identificación de otras posibles proteínas BSP mediante búsquedas en bases de datos. De esta forma se identificaron tres nuevas secuencias específicas de ovino. Por tanto, el siguiente objetivo fue tratar de determinar su presencia o ausencia en plasma seminal. Para ello, se llevó a cabo un estudio por espectrometría de masas de la fracción del plasma seminal ovino que contiene las proteínas BSP (Artículo-manuscrito 3). El estudio permitió identificar inequívocamente a RSVP14, 20 y 22, mediante la detección de una secuencia peptídica única para cada una de estas proteínas. Sin embargo, los datos obtenidos no fueron suficientes para confirmar la presencia de otras proteínas.
Debido a que tanto la concentración, como la capacidad para proteger a los espermatozoides de RSVP14 y 20 varía según la estación reproductiva (Pérez-Pé et al. 2001), otro de los objetivos fue el desarrollo de protocolos para producir estas proteínas in vitro (Artículos 1 y 2, y Artículo-manuscrito 4). La expresión de estas proteínas correctamente plegadas es compleja debido a la presencia de puentes disulfuro en su estructura, por lo que se probaron diferentes medios de expresión. No se consiguió expresarlas usando la levadura Pichia pastoris, y aunque se produjeron mediante extracto de células de insecto, la cantidad expresada fue muy pequeña. Tras probar diferentes combinaciones de plásmidos y bacterias Escherichia coli modificadas para incrementar la solubilidad, se consiguió expresar RSVP14 de forma soluble. En cambio, RSVP20 siguió acumulándose de forma insoluble en cuerpos de inclusión. Su gran cantidad nos llevó a diseñar un protocolo de solubilización y replegamiento que finalmente permitió obtener la proteína soluble. Para validar la correcta expresión de las proteínas recombinantes se comprobó su capacidad de unión a espermatozoides y el efecto que ejercen durante la capacitación y el cold-shock (Artículo-manuscrito 4). Ambas proteínas se unieron a la membrana espermática, aumentando su presencia al aumentar su concentración. La concentración también fue importante en su efecto al añadirlas previamente al cold-shock; las cantidades más bajas provocaron una disminución en la integridad de membrana, mientras que con alta concentración la integridad se mantuvo al mismo nivel que las muestras control. Su adición antes de incubar en condiciones capacitantes produjo un aumento inmediato de la motilidad, pero sin mostrar un patrón de hiperactivación. Al cabo de 3 horas de incubación, las dos proteínas habían inducido de forma significativa la reacción acrosómica manteniendo el patrón de motilidad no hiperactivada.
En conjunto los resultados obtenidos podrían tener utilidad en la biotecnología de la reproducción, particularmente en ovino, ya que proporcionan información que podría ser esencial para la mejora de los medios de criopreservación del semen en esta especie, reconduciendo los actuales sistemas de preparación y congelación de las dosis seminales, y de selección animal mediante deriva genética, hacia individuos con mayor expresión de estas proteínas.
