Implicación del sistema gstt1 en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo
- Autores: Antonio Jesús Pozo Borrego
- Directores de la Tesis: Antonio Núñez Roldán (dir. tes.), Isabel Aguilera García (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Número de páginas: 132
- Tribunal Calificador de la Tesis: Amalia Macarena Rubio Calvo (presid.), Miguel Ángel Gómez Bravo (secret.), Yolanda María Pacheco López (voc.), Rafael Ángel González Fernández (voc.), Berta Sánchez Sánchez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
Con el fin de dilucidar los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de la hepatitis inmune de novo planteamos una serie de objetivos, los cuales se recogen en el siguiente resumen: 1. Explorar la distribución celular de la proteína GSTT1 y estudiar la implicación de los anticuerpos GSTT1 específicos en el fracaso del órgano trasplantado. Con el fin de conocer si los anticuerpos GSTT1 específicos juegan un papel importante en el fracaso del injerto, decidimos estudiar si la proteína en cuestión podía expresarse en la superficie celular para su posterior reconocimiento por los anticuerpos citados anteriormente. Para ello realizamos dos abordajes experimentales distintos (inmunocitoquímica y citometría de flujo) usando la línea celular hepaRG, la cual podía conseguimos diferenciar en hepatocitos y colangiocitos. Como resultado de los experimentos realizados, podemos determinar que la proteína GSTT1 puede localizarse en la membrana celular, a pesar de ser una proteína citoplasmática. De tal forma que la escena patológica ocurriría en un ambiente de alto estrés oxidativo, provocando que la proteína GSTT1 se exprese en la membrana celular, y por tanto los anticuerpos GSTT1 específicos podrían reconocer la diana antigénica y poner en marcha los mecanismos fisiopatológicos responsables de la pérdida del órgano trasplantado. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente, decidimos estudiar muestras de suero de pacientes con y sin enfermedad para determinar las subclases de los anticuerpos anti-GSTT1, con el objetivo de determinar si existe algún patrón característico que nos permita diferenciar ambos grupos de estudio. Estos experimentos fueron llevados a cabo mediante la técnica de ELISA. Tras analizar los resultados obtenidos podemos destacar que la combinación IgG1+IgG4 es la característica mayoritaria en ambos grupos de pacientes. Además, pacientes que han desarrollado la enfermedad presentaban una proporción IgG1/IgG4 superior a 1 en el momento del diagnóstico, cosa que no ocurría en los pacientes sin esta patología. 2. Determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la proteína GSTT1. Por otro lado, decidimos estudiar la respuesta celular T y su posible implicación en el desarrollo de la HI de novo. Inicialmente, realizamos un estudio experimental con el objetivo de determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la diana antigénica. Para ello se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de pacientes de los distintos grupos de estudio, la tecnología de los pentámeros/tetrámeros y la técnica de citometría de flujo. Estos pentámeros/tetrámeros son combinaciones sintéticas de moléculas MHC con una secuencia peptídica. Mediante un programa de predicción seleccionamos las mejores combinaciones MHC-péptido. Los pentámeros llevan asociada una molécula MHC de clase I (se ensayaron 3 combinaciones distintas), mientras que los tetrámeros una molécula MHC de clase II (se ensayaron 4 combinaciones distintas). Tras analizar los resultados obtenidos, podemos determinar que tanto el grupo 1 (pacientes con la patología) como el grupo 3 (pacientes que únicamente tienen la condición de riesgo) presentan reactividad en clase I con el pentámero A*01. Esto concuerda con nuestra hipótesis, ya que los pacientes del grupo 3, al carecer de anticuerpos GSTT1-específicos, no disponen de linfocitos B alo-específicos que actúen como células presentadoras de antígeno, a pesar de presentar linfocitos T aloespecíficos. Por tanto, hemos conseguido demostrar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a una secuencia concreta de la proteína diana en combinación con una molécula MHC característica en células de pacientes. 3. Dilucidar el papel que desempeñan los linfocitos T alo-específicos de GSTT1 en el rechazo del injerto. Una vez hallada la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a GSTT1, nos planteamos esclarecer los posibles mecanismos implicados en el desarrollo de la patología. En este caso se usaron células mononucleares de sangre periférica aisladas de pacientes de los distintos grupos de estudio y la técnica de citometría de flujo. La activación de dichas células se realizó con péptidos de GSTT1. La diana antigénica se añadía al medio de cultivo y se dejaba un tiempo de incubación de 24 horas. Todos los pacientes con HI de novo presentan activación en alguna población de linfocitos T, si bien llama la atención que no son las poblaciones convencionales CD4+ o CD8+ sino sobre todo, las dobles negativas (DN) CD4- CD8- . Los datos de activación linfocitaria registrados en conjunto con la existencia de linfocitos T alo-específicos, sugieren la participación de la respuesta T en el fracaso del injerto.
