“toxoplasma gondii en la industria de elaboración de productos curados. Evaluación de métodos de detección y su aplicación al proceso de evaluación y control del riesgo”
- Autores: Paula Nieto Bressel
- Directores de la Tesis: Mª Jesús Gracia Salinas (dir. tes.), Susana Bayarri (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Regina Lazaro Gistau (presid.), Esther Sanjuán Velázquez (secret.), Joaquim Castellà Espuny (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos por la Universidad de Zaragoza
- Materias:
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- Resumen
La toxoplasmosis es una de las zoonosis más extendidas mundialmente y el agente causal de esta enfermedad es Toxoplasma gondii, protozoo intracelular obligado perteneciente al phylum Apicomplexa. T. gondii es, ¡ probablemente, el protozoo más frecuente de infección en el hombre. Se estima que el entre el 25 y el 40 % de la población está infectada, no obstante, la prevalencia en las diferentes regiones del mundo varía de acuerdo con factores económicos, sociales y culturales. La toxoplasmosis, por lo general, cursa de forma leve o asintomática en personas inmunocompetentes. Sin embargo, en personas inmunocomprometidas es una enfermedad severa, y en mujeres embarazadas existe el riesgo de transmisión al feto con graves consecuencias. De los patógenos reseñados como los agentes principales de enfermedades de transmisión alimentaria, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) identifica a Toxoplasma gondii como uno de los parásitos más importantes, evidenciando la escasez de métodos estandarizados y validados para su control. Los estudios epidemiológicos apuntan tanto al consumo de carne fresca o poco cocinada como al consumo de productos cárnicos curados como factores de riesgo. Concretamente, de entre los animales productores de carne en los que se detectan más frecuentemente los quistes de Toxoplasma, destaca el cerdo.
La EFSA considera a T. gondii como uno de los riesgos biológicos más relevantes en el contexto de la inspección de la carne de cerdo, sin embargo, en la actual legislación de la Unión Europea no existen criterios para su detección en matadero. A esto se suma que España es un país con una larga tradición en la elaboración y consumo de productos cárnicos curados, y que, de los elaborados con carne de cerdo, el jamón es uno de los productos más emblemáticos, siendo nuestro país el primer productor mundial de jamones y paletas curados. Por todo ello, las empresas del sector cárnico necesitan conocer datos científicos sobre este patógeno, controlarlo y ofrecer al consumidor un producto seguro y de calidad.
El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido contribuir al proceso de evaluación del riesgo de T. gondii en el sector cárnico porcino, en especial, en la industria de elaboración de productos curados, y aportar herramientas para su control. Para ello, se han evaluado diferentes metodologías analíticas para la detección del parásito en animales vivos, en carne y en jamón curado; se han aplicado las metodologías más fiables al estudio de la prevalencia de T. gondii en porcino en España; se ha evaluado el efecto del curado en la viabilidad del parásito; y se ha estudiado la prevalencia de T. gondii en productos curados de venta en comercios al por menor. Para realizar la evaluación de los métodos de análisis, así como de la influencia del curado en la viabilidad de T. gondii, se ha llevado a cabo una infección experimental porcina.
Se ha realizado una evaluación de las técnicas indirectas (IFI, MAT, ELISA monoespecie y ELISA multiespecies) y directas (qPCR) con la finalidad de seleccionar las más adecuadas para la detección del parásito. La técnica IFI ha permitido la detección precoz de la infección, a los 8 días p.i., frente al resto de técnicas serológicas, con las que se detectó la positividad a los 15 días p.i. Los resultados obtenidos muestran que existe una buena concordancia entre las técnicas serológicas, así como una alta repetibilidad. Tomando como referencia la IFI, la técnica ELISA multiespecie proporcionó los peores resultados de sensibilidad y veracidad relativas.
Por otro lado, la evaluación de la qPCR como metodología de detección directa en sangre ha proporcionado muy buenos resultados dado que se reveló la presencia del parásito en el 100% de los cerdos infectados.
En carne, se han evaluado distintos tratamientos de concentración de la muestra para mejorar la sensibilidad de la qPCR, como la digestión pépsica y la liofilización. Los tratamientos previos a la extracción del DNA, así como el análisis directo de la carne, no han mostrado diferencias significativas. No obstante, el hecho de que se obtuvieran valores de Ct más bajos con la digestión pépsica, unido a un informe científico externo de la EFSA que recomienda su uso para aumentar la sensibilidad de la PCR, nos ha llevado a seleccionarla como técnica de tratamiento previo para el análisis de las muestras de carne y productos cárnicos. Su aplicación al análisis de distintos tejidos porcinos (diafragma, lengua, corazón, lomo y pernil), ha mostrado que el parásito se distribuye en todos ellos, determinándose la mayor carga parasitaria en corazón y pernil. Ello permite proponer como herramienta de control de materia prima el análisis de órganos diana, de menor valor comercial que los perniles.
La técnica serológica IFI y la qPCR (previa digestión pépsica), se han aplicado al análisis de sueros y diafragmas, respectivamente, de cerdos de producción intensiva y extensiva obtenidos en mataderos de toda España, con el objetivo de aportar datos actuales de seroprevalencia porcina, así como de prevalencia de T. gondii en carne. Se analizaron un total de 1382 sueros, así como 488 diafragmas porcinos.
La seroprevalencia porcina ha sido del 28,2%, no existiendo diferencias significativas entre cerdo ibérico (27,6%) y cerdo blanco (28,7%) con un punto de corte 1:20, aunque sí hubo diferencias significativas en cuanto a títulos de anticuerpos. Éstos fueron significativamente más elevados en cerdo ibérico que en cerdo blanco. Tan sólo un 2,6% de los sueros analizadosfue de titulación igual o superior a 1:80 en cerdo blanco, mientras que en cerdo ibérico fue de un 10,9%. No obstante, sí que se observó diferencia significativa con un punto de corte 1:80, siendo la seroprevalencia total en cerdo blanco del 2,6% frente a un 10,9% en cerdo ibérico.
En relación a la presencia de T. gondii en diafragmas de cerdo blanco, la prevalencia ha sido del 9,8%, y en diafragmas de cerdo ibérico del 13,9%, observándose diferencias significativas en cuanto a carga parasitaria, siendo mayor en cerdo blanco (Ct 36,09) que en ibérico (Ct 34,45). Se observó una mayor probabilidad de detectar DNA de T. gondii en diafragma de cerdos ibéricos con títulos de anticuerpos iguales o superiores a 1:80.
Con el objetivo de evaluar la influencia del curado en la viabilidad de T. gondii, se ha llevado a cabo el curado de perniles procedentes de cerdos infectados experimentalmente, y se ha analizado, mediante bioensayo en ratón, la viabilidad de T. gondii al final del proceso tecnológico, tanto la parte interior como la exterior de cada pieza. Asimismo, se ha evaluado la técnica qPCR para la detección del DNA del parásito en los productos listos para el consumo. Además, se ha realizado un estudio preliminar con embutidos procedentes de tejidos de dichos cerdos infectados. En ambos casos, se ha analizado la composición físico-química de los productos listos para el consumo (aw, NaCl, nitratos, nitritos, grasa y pH) y se ha valorado la posible implicación de éstos en la supervivencia del parásito.
El tratamiento del curado fue eficaz frente a T.gondii, ya que el parásito no fue viable en el 52,9% de los jamones y paletas. Sin embargo, permaneció infectivo en 6 paletas y 10 jamones. En relación a la localización de la toma de muestra, se detectó mayor viabilidad de T. gondii en el interior (17,7%) que en el exterior (11,8 %) aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. El bajo porcentaje de error obtenido con la técnica qPCR aplicada a los extractos de la digestión, demuestra que es una buena alternativa al bioensayo en ratón para detectar la presencia del parásito en productos curados, de forma que podría utilizarse como técnica de cribado para posteriormente aplicar el bioensayo en ratón solamente en aquellas muestras positivas para confirmar la viabilidad del parásito. En los tres tipos de embutidos se detectó T. gondii tanto por bioensayo en ratón como por qPCR. El parásito permaneció infectivo en salchichón y longaniza pero no en chorizo, requiriéndose estudios adicionales siendo que éstos son datos preliminares. Ninguno de los parámetros físico-químicos influyó significativamente en la viabilidad de T. gondii.
Finalmente, se ha estudiado la prevalencia de T. gondii en productos curados de venta en comercios al por menor. El número de productos cárnicos curados analizados fue de 552 (311 jamones/paletas y 241 embutidos). Las muestras fueron analizadas mediante qPCR, previa digestión pépsica, antes de finalizar su fecha de consumo preferente. Las muestras positivas, fueron posteriormente analizadas mediante bioensayo en ratón para determinar la viabilidad del parásito. De todos los productos, se recogió la información que venía especificada en el etiquetado para relacionarla con los resultados obtenidos. El porcentaje de positividad y viabilidad de T. gondii ha sido de un 10,3% y un 1,1%, respectivamente, lo que supone un riesgo bajo para el consumidor.
Los datos obtenidos en la consecución de los objetivos anteriores nos han permitido establecer conclusiones y contribuir a la evaluación del riesgo actual de T. gondii derivado del consumo de jamón y productos cárnicos curados, así como plantear medidas que se recogen en una serie de recomendaciones específicas para el control rutinario de este patógeno, integradas dentro de la gestión del riesgo en el sector cárnico porcino.
