Desarrollo de métodos analíticos avanzados para la detección y caracterización de organismos modificados genéticamente

• Autores: Carlos León
• Directores de la Tesis: Alejandro Cifuentes Gallego (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2010
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: María Luisa Marina Alegre (presid.), Francisco Javier Marín Martín (secret.), Ziad El Rassi (voc.), Miguel Ángel Rodríguez Delgado (voc.), Ramón González García (voc.)
• Materias:
  • Ciencias tecnológicas
    • Tecnología de los alimentos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Esta memoria recoge los resultados más relevantes obtenidos en el desarrollo de metodologías analíticas avanzadas para la determinación y caracterización de organismos modificados genéticamente en matrices alimentarias. La memoria está dividida en siete capítulos.

    En el primero de ellos, se lleva a cabo una breve introducción sobre la situación actual y la importancia de la caracterización y el análisis de los organismos modificados genéticamente en alimentos. Además, se describen las principales técnicas instrumentales empleadas en el análisis de organismos modificados genéticamente, y se detallan algunas aplicaciones. También se presenta el objetivo general de esta Tesis Doctoral.

    En el segundo capítulo se describe el desarrollo de una metodología analítica para la detección de levaduras modificadas genéticamente en muestras de vino mediante la combinación de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple para la amplificación de ADN y su posterior análisis mediante electroforesis capilar en gel con detector de fluorescencia inducida por láser (CGE-LIF). Con el fin de evitar la inhibición de la amplificación del ADN debida a la presencia de polifenoles, taninos y otros compuestos presentes en los extractos de ADN del vino, se lleva a cabo una optimización de las condiciones de extracción de ADN a partir de vino. Posteriormente, se lleva a cabo la optimización de la PCR múltiple, empleando CGE-LIF. La elevada sensibilidad y resolución de esta técnica la convierten en una herramienta ideal para el proceso de optimización de la PCR múltiple. La metodología desarrollada se aplicó a la determinación de la cepa recombinante EKD-13 de S. cerevisiae en muestras de vino.

    En el tercer capítulo, se lleva a cabo la comparación de dos estrategias analíticas, una basada en el análisis mediante electroforesis capilar acoplada a un espectrómetro de masas de trampa de iones (CE-IT-MS) y otra en el análisis mediante electroforesis capilar acoplada a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (CE-TOF-MS), para la detección de la fracción proteica de las zeínas en muestras de maíz. En concreto, se estudia cómo afecta la variación de los parámetros instrumentales de los espectrómetros de masas a la detección de estas proteínas. Esta comparación concluye que la variación de los parámetros instrumentales afecta en mayor medida a la determinación de proteínas mediante CE-IT-MS que mediante CE-TOF-MS. Sin embargo, ambos procedimientos presentan límites de detección y reproducibilidad similares. Finalmente, las dos metodologías de análisis se aplicaron a la determinación de los perfiles de la fracción de zeínas en extractos de maíz transgénico MON810 y su correspondiente variedad convencional, sin encontrar diferencias significativas entre ambos perfiles.

    En el cuarto capítulo, se estudian las características de tres nuevas ciclodextrinas como selectores quirales. Se analiza la resolución, la sensibilidad, el tiempo de migración y la eficacia, proporcionados por cada ciclodextrina en un tampón de separación.

    Posteriormente, se lleva a cabo el desarrollo de un método de detección de aminoácidos quirales mediante CE-TOF-MS, empleando 0.5 mM de la ciclodextrina modificada seleccionada en el tampón de separación. La baja concentración de ciclodextrina necesaria para la separación de los aminoácidos quirales permite la entrada directa del tampón de separación en la interfase de electrospray originando sólo una ligera reducción de la sensibilidad. La metodología desarrollada se empleó para el análisis de aminoácidos quirales en muestras de vinagre, soja convencional y soja modificada genéticamente. Esta metodología ha permitido determinar pequeñas variaciones entre las fracciones de aminoácidos quirales procedentes de soja transgénica Roundup ReadyTM y convencional.

    En el quinto capítulo, se lleva a cabo el desarrollo de un método de análisis de perfiles metabólicos en muestras de soja transgénica Roundup ReadyTM y soja convencional, mediante el empleo de CE-TOF-MS. Para ello, se realiza una optimización de la extracción de metabolitos y de las condiciones de separación y análisis. La aplicación de la metodología desarrollada permitió detectar e identificar más de 40 metabolitos en muestras de soja. Asimismo, la comparación de los perfiles metabólicos entre la soja transgénica y su respectiva variedad convencional, permitió detectar diferencias significativas en la concentración de los metabolitos entre ambos organismos. En concreto, destaca el metabolito 4-hidroxi-L-treonina que se detectó en la variedad convencional de soja, y no se detectó en la variedad transgénica.

    El sexto capítulo se presenta dividido en dos secciones. La primera sección aborda el desarrollo de un procedimiento analítico en CE-TOF-MS para la obtención y comparación de perfiles metabólicos en tres variedades de maíz transgénico y sus correspondientes variedades convencionales. Esta metodología permitió detectar más de 25 metabolitos en cada una de las variedades de maíz. Además, la comparación de los perfiles metabólicos permitió detectar diferencias estadísticamente significativas entre las variedades transgénicas y sus correspondientes variedades convencionales. En concreto, se ha demostrado que los metabolitos L-carnitina y estaquidrina, se encuentran en concentraciones más elevadas en las tres variedades transgénicas investigadas que en sus respectivas variedades convencionales. La segunda sección se basa en un estudio pormenorizado de la composición de metabolitos en extractos de maíz transgénico y convencional, mediante la combinación de técnicas de espectrometría de masas, con técnicas de separación y técnicas de extracción. En esta sección se demuestra que la combinación de la información de la movilidad electroforética de los compuestos junto con la gran exactitud de la masa molecular proporcionada por un espectrómetro de masas de resonancia ion ciclotrón con transformada de Fourier (FT-ICR-MS) es una estrategia apropiada para la identificación de metabolitos. Además, se demuestra que el empleo de técnicas de extracción selectiva (como la extracción con líquidos presurizados, PLE) permite obtener información útil para la identificación de metabolitos. Finalmente, mediante el empleo de estas técnicas se obtuvieron diferencias en los perfiles metabólicos entre las variedades transgénicas de maíz y sus correspondientes variedades convencionales, sobre todo en algunas rutas relacionadas con el metabolismo de los aminoácidos.

    En el séptimo y último capítulo se recogen las conclusiones finales de los trabajos realizados. En el anexo se presentan las publicaciones a las que esta Tesis Doctoral ha dado lugar.