Modificación genética de levaduras vínicas industriales para mejorar la producción de aroma secundario.

• Autores: Genoveva Uber García
• Directores de la Tesis: Emilia Matallana Redondo (dir. tes.), Daniel Ramón Vidal (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2007
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Albert Mas Barón (presid.), Marcel.li del Olmo Muñoz (secret.), Isabel López Calderón (voc.), José Vicente Gil Ponce (voc.), Ramón González García (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen
  • español

    El aroma es una de las propiedades organolépticas más valorada para determinar la calidad de un vino. Se caracteriza porque está determinado por cientos de compuestos volátiles de diversa naturaleza química que se encuentra a concentraciones muy bajas .

    En términos enológicos el perfil aromático de un vino se clasifica en tres categorías denominadas, aroma primario, secundario y terciario. El aroma primario se compone de sustancias que proceden directamente de la variedad de uva utilizada y de los compuestos que se generan en el transcurso de la manipulación y acondicionamiento del mosto. El aroma secundario, es el que se atribuye a los compuestos generados durante el proceso de fermentación por el metabolismo de las levaduras vínicas. El aroma terciario, está constituido por sustancias que se sintetizan como consecuencia de las reacciones enzimáticas y/o físico-químicas en el proceso de envejecimiento del vino. Pese a esta clasificación, el aroma genérico de fondo, se atribuye mayoritariamente, a compuestos aromáticos volátiles sintetizados por la levadura vínica S. cerevisiae a lo largo de la fermentación alcohólica. Los metabolitos secundarios más relevantes en el aroma genérico de fondo son los ésteres volátiles con fragancias aromáticas y sus correspondientes precursores alcohólicos cuya producción depende del balance de actividades alcohol acetiltransferasa y éster hidrolasa. Las alcohol acetiltransferasas, codificadas por los genes ATF1 y ATF2, catalizan la síntesis de ésteres volátiles a partir de un alcohol superior y acetil-CoA. La esterasa, codificada por el gen IAH1, hidroliza los ésteres de acetato rindiendo acetato y el alcohol constituyente.

    Dada la importancia que el metabolismo de la levadura S. cerevisiae ejerce en la producción de compuestos volátiles responsables del aroma de fermentación, fundamentalmente ésteres de acetato y alcoholes, en este trabajo se han desarrollado distintos tipos de estrategias moleculares basadas en técnicas de ingeniería metabólica.

    Todas ellas encaminadas a incrementar el aroma secundario originado por la levadura vínica en forma de ésteres de acetato y alcoholes superiores.

    En primer lugar se realizó un estudio de la implicación de las distintas actividades de síntesis y de degradación que contribuyen en la producción de volátiles. Dicho estudio se centró en el análisis cuantitativo de la acumulación de ésteres y alcoholes en distintos tipos de cepas mutantes que carecen de los genes ATF1, ATF2 e IAH1. Los datos obtenidos muestran que la enzima codificada por el gen ATF1 participa de forma mayoritaria y por este orden en la síntesis de acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, acetato de 2-feniletilo. Además, indican que la proteína Atf2 también interviene en el proceso de síntesis, aunque su participación es cuantitativamente menor. Finalmente se concluye que la proteína Iah1 interviene en la degradación de estos mismos compuestos.

    Posteriormente, las estrategias de ingeniería metabólica desarrolladas fueron las siguientes:

    1.- Sobreproducción de ésteres de acetato por sobreexpresión del gen ATF1 bajo el control del promotor del gen glicolítico TDH3. Con esta estrategia de consiguió incrementar, del orden de 50 veces, la concentración de ésteres volátiles en condiciones de vinificación.

    2.- Sobreproducción de volátiles por deleción de la éster hidrolasa Iah1. En este caso se consiguió duplicar la acumulación de dichos compuestos.

    3.-Sobreexpresión del gen que codifica la a-cetoisocaproato descarboxilasa implicada en la conversión del a-cetoisocaproato en alcohol isoamílico. Con esta estrategia no se consiguió incrementar la cantidad del precursor alcohólico y/o éster de acetato acumulado.

    En conclusión, la estrategia más adecuada para incrementar y/o mejorar el aroma secundario en el vino es obtener una levadura vínica industrial genéticamente modificada que contenga una expresión fuerte y constitutiva del gen ATF1.

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  • English

    Flavour is a wines most important distinguishing characteristic that stem from a complex, completely non-linear system of interactions among many hundreds of compounds. Wine flavour is classified according to the sources of the different compounds contributing to it. This include varietal flavour, flavour compounds originating from the grapes, fermentative flavour, produced by yeast during alcoholic fermentation and post-fermentative flavour, compounds that appear during the ageing process through enzymatic or physicochemical actions. It is well known that during fermentation processes, yeast cells produce a broad range of aroma-active substances, which greatly affect the complex flavour of wine. While these secondary metabolites are often formed only in trace amounts, their concentrations determine the flavour profile of these beverages. In the main secondary metabolites synthesised for S.

    cerevisiae are the volatile esters. Their are the product of an enzyme-catalyzed condensation reaction between acetyl-CoA and a higher alcohol. Several different enzymes are involved in formation of esters, which are encoded by genes ATF1 and ATF2. Furthermore, they can be hydrolyzed by esterase like IAH1 gene product.

    Therefore, a balance of these two enzyme activities controls accumulation of volatile esters.

    The aims of this study are to develop several molecular strategies to construct wine yeast strain that improve accumulation of acetate esters through genetic engineering.

    The strategies develops were:

    1.- Construct disruptant strain that were lose ATF1, ATF2 and IAH1 gene, to resolve implication of gene product in volatile production.

    2.-Ester overproduction by regulated over expression of ATF1 gene controlled TDH3 promoter gene and disruption IAH1 gene 3.- Alcohols over production by over expression of THI3 gene.

    In conclusion, this study has demonstrated that in the main strategy for improve fermentative flavour in wine is construct a genetically modified wine yeast which have heave and constitutive over expression of ATF1 gene