Estudio del potencial patógeno de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de suplementos dietéticos y probióticos
- Autores: Silvia Llopis Pla
- Directores de la Tesis: Amparo Querol Simón (dir. tes.), María Teresa Fernández-Espinar García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Molina Martín (presid.), Óscar Zaragoza Hernández (secret.), José Francisco Cano Lira (voc.)
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- Resumen
La levadura Saccharomyces cerevisiae es la especie más utilizada desde un punto de vista biotecnológico. Además, se emplea como suplemento dietético y como agente probiótico bajo el nombre de S. cerevisiae var. boulardii. Hasta ahora, su consumo se había considerado beneficioso por sus propiedades biofuncionales y su valor nutritivo intrínseco, y por otra parte, seguro, dado el carácter “GRAS” (de Generally Recognized As Safe) que se atribuye a esta especie de levadura; sin embargo, actualmente se considera a S. cerevisiae dentro del grupo de patógenos oportunistas emergentes de baja virulencia, capaz de causar infecciones principalmente en hospedadores inmunodeprimidos. Con el fin de conocer el posible papel de esta levadura como patógeno emergente, se obtuvieron en este trabajo cepas de S. cerevisiae a partir de 8 productos dietéticos comerciales con levadura de un total de 22 analizados, con el fin de valorar el potencial patógeno de dichas cepas; en primer lugar, una vez aisladas estas levaduras se aplicaron técnicas moleculares de identificación (análisis de restricción de la región ribosomal 5.8S-ITS) y de caracterización (análisis de restricción del DNA mitocondrial y amplificación por PCR de elementos delta); con la identificación se demostró que 6 de estos aislados pertenecían a la especie S. cerevisiae y 2 fueron híbridos interespecíficos (S. cerevisiae x S. kudriavzevii y S. cerevisiae x S. bayanus). Con la caracterización, se demostró que de estos 8 aislados, 4 de ellos eran la misma cepa de levadura, por tanto, finalmente se obtuvieron 5 aislados de levadura identificados como diferentes. En segundo lugar, una vez obtenidos estos 5 aislados, se llevó a cabo un estudio de rasgos fenotípicos in vitro asociados con la virulencia en levaduras patógenas, como fueron el crecimiento a altas temperaturas, secreción de enzimas extracelulares (proteasas y fosfolipasas), crecimiento pseudofilamentoso y crecimiento invasivo. Se observó que los aislados híbridos presentaron negatividad para la mayoría de estos rasgos estudiados, mientras que el resto de aislados analizados, a los cuales denominamos D2, D4 y D14 presentaron estos rasgos fenotípicos con un nivel alto a moderado, indicando que estos aislados podrían poseer capacidad infectiva independientemente del sistema inmune del hospedador. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio de infección sistémica in vivo en ratones inmunocompetentes BALB/c estudiando el alojamiento de estas levaduras en cerebro y riñón a los 7, 15 y 30 días postinfección. Se demostró que el aislado híbrido ensayado, denominado D23, mostró incapacidad para colonizar ambos órganos, mientras que los aislados D2, D4 y D14 mostraron alojamientos en cerebro y riñón, siendo el aislado D14 el que mostró mayor potencial patógeno , ya que fue el único que causó mortalidad en ratones. Se estableció un modelo murino de infección gastrointestinal imitando condiciones clínicas habituales de trauma e inmunosupresión para valorar la capacidad de translocación intestinal y diseminación de cepas de S. cerevisiae. Este estudio se llevó a cabo con el aislado virulento D14 y con el aislado avirulento D23. Se demostró que ambos aislados fueron capaces de atravesar la barrera intestinal, mientras que sólo se detectó diseminación consistente en órganos distantes, como hígado, riñones, cerebro y nódulos mesentéricos en el caso del aislado virulento D14. A continuación, se procedió a llevar a cabo un análisis genómico de 4 cepas de S. cerevisiae, en las cuales se incluía el aislado D14, una cepa de laboratorio avirulenta W303 y dos aislados clínicos virulentos (60 y 102) estudiados previamente en nuestro grupo. Se mostró variabilidad en la composición genómica entre las zonas subteloméricas de estos aislados, siendo ésta mayor en los aislados virulentos (D14, 60 y 102). Además, la mayoría de los genes que presentaban variación en el número de copias se situaban en estas regiones. También se observó una aneuploidía en el aislado clínico 60, la cual podría proporcionar una ventaja selectiva sobre ciertas condiciones ambientales. Se vieron también cambios en el número de copias de genes relacionados con la reparación de bases causada por daño oxidativo o de genes del metabolismo del glutation. Por otra parte, se realizó un estudio comparativo de la supervivencia en sangre humana de las cepas virulentas D14 y 60 y la cepa de laboratorio avirulenta W303, donde se demostró que las cepas virulentas fueron capaces de sobrevivir en sangre humana y el porcentaje de supervivencia fue equivalente al de una cepa patógena ensayada de la especie C. albicans. Utilizando el modelo de supervivencia en sangre humana, se llevó a cabo un análisis transcriptómico de los aislados virulentos D14 y 60, la cepa de laboratorio W303 y una cepa vínica avirulenta CECT 10.431. Se observó una respuesta transcripcional específica por parte de los aislados virulentos (D14 y 60) de genes implicados en la biosíntesis y metabolismo de aminoácidos y en genes de respuesta al estrés oxidativo. Además, tras la aplicación de un estrés oxidativo, las cepas virulentas mostraron mayor resistencia que las cepas avirulentas (CECT 10.431 y W303), sugiriendo una correlación entre la resistencia al estrés oxidativo y la patogenicidad. Por último, los cambios observados en el análisis genómico no se pudieron correlacionar con el nivel de expresión de estos genes en el análisis transcriptómico. Por tanto, cabe pensar que una expresión diferencial entre cepas virulentas y avirulentas sea resultado de la adaptación de las primeras al medio sanguíneo. Este estudio podría ser de gran interés para todas aquellas industrias alimentarias que incluyen a S. cerevisiae en sus preparados, con el fin de evitar la administración de dichas cepas de levaduras a individuos inmunodeprimidos. Puesto que el carácter híbrido no parece conferir habilidad infectiva, el uso de este tipo de cepas en la preparación de suplementos dietéticos podría ser garantía de seguridad.
