Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

• Autores: Anna Jofré Fradera
• Directores de la Tesis: Maria Pla i de Solà-Morales (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2004
• Idioma: catalán
• ISBN: 84-689-0621-2
• Depósito Legal: Gi-1595-2003
• Tribunal Calificador de la Tesis: María Luisa Molinas de Ferrer (presid.), Rafael de Llorens Duran (secret.), Leonor Alegre Batlle (voc.), Josep Maria Casacuberta i Suñer (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen
  • English

    Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described.

    2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the ?-crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole ?-crystallin domain in E. coli cells shows that most of the ?-crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the ?-crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells.

    Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.

  • català

    Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, dentre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI sha descrit que sindueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid dhidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També sexpressen durant el desenvolupament, per exemple durant lembriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de lembrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a lestrès i lacumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars daquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules dE.coli en condicions destrès tèrmic.

    Lestudi de lacumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons dacumulació complexos i formats per dos grups despècies proteiques principals, a lentorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i lestrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa sindueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups despècies proteiques sacumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini ?-cristal.lí que fa que a la proteïna que sen dedueix li manqui un 55% del domini ?-cristal.lí i tota lextensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. Lanàlisi de lexpressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant loportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per lestudi de la importància del domini ?-cristal.lí i lextensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules dE. coli en condicions destrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront lestrès oxidatiu.

    Lestrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions destrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, sha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en lmRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus dRNA devolució ràpida com el virus de lHepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb lobjectiu daprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització denzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb lestrès oxidatiu. En conseqüència, lestrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de lelevada taxa de mutació detectada. Dacord amb això, el tipus majoritari de productes doxidació de les bases del DNA que sacumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid dhidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en lmRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat daquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules dmRNA de rel, un teixit en el qual no shavia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb lestrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.