A study on the phylogeny and the ecology of ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene amoB
- Autores: Laia Calvó Perxas
- Directores de la Tesis: L. Jesús García Gil (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2005
- Idioma: inglés
- ISBN: 84-689-3087-3
- Depósito Legal: GI.872-2005
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carles Abella Ametller (presid.), Maria Dolors Balaguer Condom (secret.), Erik Lindgren (voc.), David Rodríguez Lázaro (voc.), Emilio Ortega Casamayor (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
- English
Human activities such as farming and industrialization have produced a significant increase in the number of ammonium-rich environments. The presence of nitrogenated compounds reduces water quality causing toxicity problems, deteriorating the environment and even affecting human health. Consequently, nitrification has recently become a widespread process involving the cycling of nitrogen in the biosphere, which is mainly due to microbial activities. Ammonia oxidizing bacteria (AOB) are an essential component of the global cycling of nitrogen, being responsible for the aerobic oxidation of ammonium to nitrite.
Although the first ammonia oxidizers were isolated by the end of the XIX century, the slowness of their growth and the difficulties in culturing hindered achieving a full knowledge of this bacterial group until the 80s, when the first studies based on the gene 16S rDNA where performed. Nowadays, the databases contain huge numbers of entries of 16SrDNA sequences belonging to AOB.
The aim of this work was to find, develop, and evaluate useful and reliable tools for the study of ammonia oxidizers in environmental samples.
In this work we describe the use of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), based on the use of DNA probes specifically targeting the ammonia-oxidizers 16SrRNA molecule. AOB were detected and enumerated by using this technique. However, unknown sequences are hardly detectable by using this method, and therefore, new tools were needed.
For this purpose we tried applying the sequence of the probe Nso1225 in a PCR reaction. The possibility of specifically amplifying a 16S rDNA gene fragment resulted in a new fingerprinting tool to assess the presence and diversity of ammonia-oxidizers in natural environments. Even so, some ßProteobacterial nonAOB sequences were also retrieved by using this technique. Moreover, one of the main disadvantages of using 16S rDNA as a molecular marker is the impossibility of simultaneously detecting both the ß and the ?Proteobacterial ammonia oxidizers.
The gene amoA, which encodes for the subunit A of the enzyme ammonia monooxygenase, was then being extensively used as a marker for the detection of AOB in environmental samples. We describe the use of this marker for the identification of several ammonia oxidizing sequences in sludge samples from a sequencing batch reactor (SBR). Although useful, the use of amoA as a marker requires cloning, which is a tedious and time-consuming technique when dealing with large number of samples in microbial ecology studies. Besides, detection of nonAOB sequences has been reported by other authors when using amoA in a PCR-DGGE approach.
Aiming at obtaining a fast and rigorous analytical tool allowing AOB detection and identification, we developed a new set of primers targeting the gene amoB, which encodes for the transmembrane domain of the enzyme ammonia monooxygenase. This gene has been shown to be a good molecular marker for AOB, since it can be used for easy detection and identification of ammonia oxidizers, providing high specificity, sensitivity and reliability regardless of phylogenetic affiliations.
A real-time PCR assay for the detection and quantification of the ?proteobacterial genus Nitrosococcus based on the amoB gene sequence is also presented. This newly designed primer set allows a highly sensitive and specific enumeration of all known Nitrosococci.
We finally performed a comparison and evaluation of the markers amoA, amoB and 16S rDNA, and built a polygenic based tree.
As a result we conclude that amoB is a suitable molecular tool for detecting and identifying AOB in environmental samples, yielding consistent grouping when performing phylogenetic inferences. In turn, the whole sequence of the gene 16S rDNA is indicated for taxonomical and phylogenetic purposes when working with ammonia oxidizing isolates.
- English
Lagricultura i la industrialització han causat un augment significatiu del nombre dambients rics en amoni. La presència de compostos nitrogenats redueix la qualitat de laigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqüència, la nitrificació sha convertit en un procés global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors damoni (AOB) són els responsables de loxidació de lamoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen.
Els primers oxidadors damoni foren aïllats a finals del segle XIX, però la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no sassolís un coneixement complert daquest grup bacterià. Actualment les bases de dades contenen multitud dentrades amb seqüències corresponents a AOB.
Lobjectiu daquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines útils i fiables per a lestudi dels AOB en mostres ambientals.
En aquest treball primer descrivim la utilització de la hibridació in situ amb fluorescència (FISH), mitjançant laplicació de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacterià; no obstant, aquest mètode no permetia la detecció de noves seqüències, pel que es necessitava una nova eina.
Amb aquesta intenció vam aplicar la seqüència de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet damplificar específicament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament duna nova eina molecular que permetia detectar la presència i diversitat daquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqüències pertanyents a bacteris no oxidadors damoni del subgrup ß dels proteobacteris, eren també obtingudes amb aquesta tècnica. Així mateix, un dels inconvenients de lús del 16SrDNA com a marcador és la impossibilitat de detectar simultàniament els AOB que pertanyen als subgrups ß i ? dels proteobacteris.
El gen amoA, que codifica per la subunitat A de lenzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores àmpliament utilitzat com a marcador per a la detecció dels AOB. En aquest treball també descrivim la utilització daquest marcador en mostres procedents dun reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqüències de AOB en la mostra, però la necessitat de detectar amoA mitjançant clonatge fa que lús daquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilització com a eina en estudis decologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat lobtenció de seqüències de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE.
Amb la finalitat dobtenir una eina ràpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou doligonucleòtids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de lenzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenètiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat.
En aquest treball també presentem una anàlisi de RT-PCR basada en la detecció del gen amoB per a la quantificació del gènere Nitrosococcus. El nou joc doligonucleòtids dissenyat permet una enumeració altament específica i sensible de tots els ?Nitrosococcus coneguts.
Finalment, vam realitzar un estudi poligènic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vàrem construir un arbre filogenètic combinat.
Com a resultat concloem que amoB és un marcador adequat per a la detecció i identificació dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferències filogenètiques. Per altra banda, la seqüència sencera del gen 16S rDNA és indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonòmiques i filogenètiques en treballar amb cultius purs de AOB.
- English
