Estudio de las actividades α- y β-galactosidasas de Lactobacillus plantarum WCFS1 para el diseño eficaz de nuevos oligosacáridos y derivados galactosilados de polialcoholes no digeribles

• Autores: Paloma Delgado Fernández
• Directores de la Tesis: Francisco Javier Moreno Andújar (dir. tes.), Nieves Corzo Sánchez (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Número de páginas: 327
• Tribunal Calificador de la Tesis: Laura Jaime de Pablo (presid.), Mónica Rodríguez García-Risco (secret.), Ana Isabel Ruiz Matute (voc.), Sonia Morante Zarcero (voc.), César Mateo González (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Agrícola por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Agroquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • El rápido crecimiento de la población junto con la necesidad de desarrollar nuevos alimentos más saludables y que, además, tengan efectos beneficiosos en el organismo, ha dado lugar a que la investigación se oriente a la obtención de nuevos ingredientes funcionales, diferentes de los que existen actualmente en el mercado, como es el caso de los sustitutos del azúcar, utilizando, preferiblemente, sustratos naturales o mediante metodologías sostenibles y seguras. Muchos de estos compuestos son oligosacáridos obtenidos mediante enzimas de origen microbiano, como FOS y GOS, siendo estos compuestos reconocidos prebióticos. En los últimos años se han desarrollado estrategias para la obtención de enzimas modificadoras de carbohidratos a partir de especies del género Lactobacillus o Bifidobacterium que permiten sintetizar oligosacáridos funcionales, a partir de azúcares simples, con potencial bioactivo. De entre todos los microorganismos, Lactobacillus plantarum WCFS1 es un microorganismo versátil para el estudio de nuevas actividades enzimáticas, ya que su genoma está completamente secuenciado. A pesar de que posee un elevado número de genes identificados que podrían codificar un gran número de enzimas implicadas en la hidrólisis y síntesis de nuevos oligosacáridos bioactivos, existe un conocimiento muy limitado acerca de sus mecanismos de acción ya que muchas de ellas no se han estudiado. El objetivo de esta Tesis Doctoral, dividida en 3 bloques, se ha centrado en realizar un estudio en profundidad de las actividades de dos enzimas modificadoras de carbohidratos (MelA y LacA) expresadas por Lactobacillus plantarum WCFS1 para su utilización en la obtención de nuevos oligosacáridos y derivados galactosilados de polialcoholes con nuevas propiedades bioactivas o mejoradas y con interés en el ámbito alimentario y nutracéutico, En el Bloque I se caracterizó bioquímicamente la enzima MelA Lp_3485 (GH36), anotada en la base de datos de CAZy como α-galactosidasa, y se estudió su especificidad de sustrato mediante diferentes carbohidratos de partida, observando que esta enzima poseía alta selectividad y eficiencia hacia la hidrólisis de los enlaces α (1 → 6) entre residuos de galactosas, así como de galactosa y glucosa, cuando se utiliza melibiosa y rafinooligosacáridos (RFOS) como sustratos iniciales. El estudio de su mecanismo de acción permitió comprobar su alta regioselectividad, eficiencia, versatilidad y su capacidad para catalizar reacciones de -transgalactosilación con especial preferencia por el grupo hidroxilo del carbono 6 de la galactosa para producir α-GOS (Capítulo 1). Debido a que las α-galactosidasas se han utilizado en reacciones enzimáticas utilizando diferentes aceptores y donadores de residuos de carbohidratos dando lugar a heterooligosacáridos (HOS) con propiedades bioactivas, en el Capítulo 2, se investigó la formación de estos HOS a través de la capacidad hidrolítica y de transgalactosilación de MelA Lp_3485 utilizando melibiosa (como donador de residuos de galactosa) y otros disacáridos(aceptores de residuos de galactosa) con enlaces α- (isomaltosa y isomaltulosa) y β-glicosídicos (lactulosa, lactosa y celobiosa). Se pudo observar, de nuevo, su alta capacidad para transferir la galactosa de la melibiosa a su respectivo aceptor. Se evaluó el grado de digestibilidad de los derivados obtenidos mediante un extracto de intestino delgado de rata (RSIE), observando que, con la excepción de los derivados de isomaltosa, el resto de HOS mostraron una elevada resistencia a la digestión intestinal de mamíferos. Además, se realizó una exhaustiva caracterización por RMN de uno de los HOS formados, concretamente del derivado de la reacción de melibiosa y lactulosa, previa purificación de la mezcla de reacción.

    En el Bloque II, se continuó profundizando en el estudio de las actividades de las enzimas modificadoras de carbohidratos de Lactobacillus plantarum WCFS1 y concretamente de la enzima LacA Lp_3469 (GH42), considerada como β-galactosidasa (Capítulo 3). En primer lugar se realizó la caracterización bioquímica y posteriormente se estudió su capacidad hidrolítica y de transglicosilación utilizando diferentes tipos de sustratos. Esta enzima presentó una alta capacidad hidrolítica frente a sustratos con enlaces β (1 → 4) entre galactosa y glucosa (lactosa) y entre galactosa y fructosa (lactulosa) pero baja eficiencia en la transgalactosilación para formar β-GOS. Debido a la capacidad de ciertas β-galactosidasas de transferir residuos de galactosa a otros aceptores distintos de carbohidratos, como polialcoholes, se estudió la capacidad de transgalactosilación de la enzima LacA (Lp_3469) utilizando lactosa con diferentes polialcoholes para formar derivados de polialcoholes galactosilados. Los polialcoholes son un grupo de carbohidratos que se utilizan como sustitutos del azúcar debido a su poder edulcorante entre otras propiedades, pero pueden absorberse en el intestino delgado, de ahí el interés de formar los derivados galactosilados que puedan llegar al intestino grueso y allí ser metabolizados por la microbiota colónica. Se comprobó la alta selectividad de la enzima LacA para la formación de derivados de polialcoholes y se obtuvieron, por primera vez, derivados galactosilados de polialcoholes (concretamente de eritritol y xilitol). Los derivados galactosilados del xilitol fueron posteriormente caracterizados por RMN.

    En el Bloque III se observó que estos oligosacáridos derivados del xilitol fueron resistentes a la digestión por las disacaridasas incluidas en el RSIE. Asimismo, se realizó un estudio con diferentes soportes heterofuncionales para la inmovilización de la enzima LacA, con el fin de poder producir derivados galactosilados del xilitol a gran escala de forma sostenible. De todos los soportes utilizados, la enzima inmovilizada con agarosa con grupos IDA-Zn-CHO fue la más estable, incluso mejor que la enzima en forma soluble. La enzima inmovilizada mejoraba considerablemente el rendimiento de síntesis de los derivados galactosilados del xilitol, preservando su actividad después de 10 usos, lo que podría ser una herramienta muy interesante a nivel industrial (Capítulo 4).

    Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral amplían los conocimientos existentes acerca del mecanismo de acción de las enzimas modificadoras de carbohidratos de Lactobacillus plantarum WCFS1, así como en la producción de nuevos oligosacáridos hipocalóricos con potenciales propiedades, como su capacidad prebiótica. Características estructurales como la composición monomérica, grado de polimerización y tipo y configuración anomérica de los enlaces glicosídicos característicos de los nuevos oligosacáridos podrían jugar un papel fundamental en su resistencia a la digestión intestinal y en la fermentación colónica, pudiendo presentar propiedades biológicas de mayor interés frente a las de sus respectivos sustratos de partida.