Desarrollo de nuevas metodologías avanzadas para el análisis de oligosacáridos bioactivos

• Autores: Andrea Martín Ortiz
• Directores de la Tesis: Francisco Javier Moreno Andújar (dir. tes.), M. Luz Sanz Murias (dir. tes.), Ana Isabel Ruiz Matute (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2019
• Idioma: español
• Número de páginas: 255
• Tribunal Calificador de la Tesis: Maria Yolanda Madrid Albarran (presid.), Noelia Rosales Conrado (secret.), José Angel Gómez Ruiz (voc.), Miguel Herrero Calleja (voc.), Alfonso Clemente (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Avanzada por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Química analítica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen

  • En la presente memoria se exponen los resultados más relevantes del trabajo titulado ¿Desarrollo de nuevas metodologías avanzadas para el análisis de oligosacáridos bioactivos¿. En dicho trabajo se han optimizado, validado y aplicado diferentes métodos analíticos basados en cromatografía de gases (GC) y de líquidos (LC), acopladas a espectrometría de masas (MS), con el fin de superar muchas de las limitaciones asociadas a las metodologías hoy en día en uso para el análisis de oligosacáridos bioactivos, destacando los oligosacáridos de leche de cabra (COS).

    La leche de cabra es una fuente rica de carbohidratos, mayoritariamente constituida por lactosa, pero también por varios oligosacáridos bioactivos y de especial interés. El análisis de estos oligosacáridos no es una tarea sencilla y normalmente requiere de un paso previo de fraccionamiento para eliminar la lactosa. Para ello, en esta tesis, se han empleado técnicas biotecnológicas basadas en el uso combinado de enzimas con actividad ß galactosidasa que hidrolicen la lactosa pero conserven el perfil de COS y de levaduras que eliminen los productos de hidrólisis producidos. Otra técnica empleada en esta tesis para el fraccionamiento de la lactosa ha sido la cromatografía de exclusión molecular (SEC) que permite la separación de los oligosacáridos por su grado de polimerización.

    Gracias a estos métodos de fraccionamiento, los COS han sido identificados y caracterizados mediante técnicas cromatográficas. Dentro de ellas, la GCMS es una técnica ampliamente utilizada para el análisis de carbohidratos de bajo peso molecular debido a su alta resolución, eficiencia y capacidad de identificación, sin embargo, es necesaria una etapa previa de derivatización de la muestra. Para ello, en esta tesis se han optimizado las condiciones de derivatización (tiempo, temperatura y reactivo de sililación) de diferentes patrones de carbohidratos. El método desarrollado se ha aplicado de manera exitosa a una muestra de leche de cabra.

    La LC es otra de las técnicas más empleadas por su alta versatilidad y múltiples modos de operación. En esta tesis se combina el empleo de la cromatografía líquida con columna de nano-chip acoplada a espectrometría de masas con analizador de cuadrupolo-tiempo de vuelo (nano LC Chip Q ToF MS) para la identificación de 78 oligosacáridos de calostro de cabra y la cromatografía de interacción hidrofílica acoplada a espectrometría de masa con analizador de cuadrupolo (HILIC Q MS) para la cuantificación de los mayoritarios. Esta combinación se empleó para llevar a cabo por primera vez un estudio exhaustivo de la evolución de los COS, tanto neutros como ácidos, durante diferentes etapas de lactación.

    Por otro lado, en esta tesis la cromatografía de líquidos también se ha aplicado para el análisis de carbohidratos con distintas unidades monoméricas, grados de polimerización y enlaces glicosídicos, combinando diferentes modos de operación como la HILIC y la cromatografía de carbón grafitizado (GCC), para estudiar el comportamiento cromatográfico de disacáridos y técnicas espectrométricas como MS en tándem (MSn). Así se ha conseguido establecer un perfil estructural completo y se ha podido caracterizar trisacáridos con diferentes estructuras. También se ha desarrollado un método mediante LCxLC para el análisis de estos carbohidratos, derivatizándolos previamente con ácido 4-aminobenzoico (ABEE). Se empleó una combinación ortogonal HILIC x fase inversa (RP) usando una interfase con modulación activa. Este método se aplicó con éxito al análisis, por primera vez, de mezclas complejas de patrones de oligosacáridos y de mezclas comerciales de genti-oligosacáridos y galactooligosacáridos prebióticos.

    Los resultados descritos en esta Tesis suponen una contribución destacable en el estudio de carbohidratos bioactivos y en el empleo de las técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas.